一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建制造技术

本发明专利技术属于花生分子育种技术领域，具体涉及一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建。本发明专利技术利用农杆菌侵染法将川鄂爬山虎白藜芦醇合成酶RS基因全长序列(1179bp)转化花生，经PCR、Southern印记杂交、Northern杂交等分子生物学检测，证明白藜芦醇合成酶基因RS已整合到花生的基因组中。本发明专利技术利用转基因技术提高花生中的RS含量，在改善花生抗性的同时促进下游产物白藜芦醇的含量增加，为研究RS基因代谢产物的生物学功能及调控机制提供了理论基础，为改良物种抗性和提高代谢物产量提供了一种有效途径。效途径。效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建


[0001]本专利技术属于花生分子育种
，具体涉及一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建。

技术介绍

[0002]花生(Arachis hypogaea L.)是全球第四大油料作物，也是中国重要的经济和油料作物之一，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和品质。随着生物技术的发展，利用转基因技术来改进花生栽培种受到研究者的广泛重视。
[0003]白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一种天然的多酚类植物抗毒素，具有显著的抗癌活性，主要存在于虎杖、葡萄和花生中，白藜芦醇具有抗氧化、抗增殖、促凋亡、抗衰老和免疫调节作用，在癌症和免疫系统疾病的治疗中得到广泛的应用。白藜芦醇最早是从毛叶藜芦根部提取物中获得的，目前已从70多种植物中获取。研究表明：虎杖、葡萄、花生中含量较高。白藜芦醇合成酶(RS)是催化丙二酰辅酶A和香豆酰辅酶A反应的关键酶，催化的最终产物是白藜芦醇。RS酶的催化反应是一系列的缩合反应，也是影响白藜芦醇生物合成的重要调控酶。可见，RS基因在植物、微生物功能的改造方面具有良好的应用前景。
[0004]近年，白藜芦醇的功能和开发利用的研究已取得了很大的进展，但RS基因如何参与胁迫响应及其作用机制还有待深入研究，随着可持续农业的发展和人类对药物、保健品的不断需求，利用植物基因工程技术提高白藜芦醇产量以迫在眉睫。随着白藜芦醇合成酶RS基因的不断克隆和改良，加上利用RS基因进行农作物、药物和微生物的遗产改良及新品种培育也在有序进行中，通过转入白藜芦醇合成酶RS基因从而提高受体植物自身的营养附加值以及重组微生物中Res的产量，才能够满足Res在食品、保健和医药等行业的需求。可见，通过基因转化技术将RS基因转化到花生中，有望提高花生的抗逆性以及白藜芦醇的产量，进而提高花生的经济价值。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，通过转入白藜芦醇合成酶RS基因，从而提高花生的抗逆性以及白藜芦醇的产量，提高花生的经济价值。
[0006]为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术提供了一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，该方法包括以下步骤：
[0008]S1、将质粒pCAMBIA3300
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RJ39
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RS
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Tnos转化到农杆菌感受态LBA4404中，并将筛选的阳性菌落在含Rif，Sm和Kan的培养基中培养至对数生长期，制得农杆菌菌液；
[0009]S2、将花生无菌苗叶片切成小片，然后用步骤S1的农杆菌菌液进行侵染，侵染后放入MS0培养基中共培养，再转移到再生培养基上进行分化培养，分化培养后再转移到生根培
养基上进行生根培养，最后将生根花生苗移栽至温室培养。
[0010]白藜芦醇合成酶(Resveratrol synthase,RS)是白藜芦醇(Resveratrol,Res)合成途径中的关键酶，在植物的代谢及调控等方面发挥重要的生物学作用。本专利技术的白藜芦醇合成酶RS基因是从川鄂爬山虎中克隆得到的，其苷酸序列长1179bp，编码392个氨基酸(王晓丽.转基因植物中白藜芦醇生物合成的调控[D].石河子大学,2007；钱昆.白藜芦醇合酶基因对草莓遗传转化的研究[D].福建农林大学,2010.)，该基因与GenBank登录号为FM955393的花生白藜芦醇合成酶基因的同源性为84.41％。鉴于启动子对基因的表达及受体植物所表现的生理生化特性具有重要的调控作用，本专利技术利用草莓果实特异性启动子RJ39构建的pCAMBIA3300
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RJ39
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RS
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Tnos植物表达载体转化花生，旨在花生的果实中获得RS基因的过表达，通过转入川鄂爬山虎克隆的RS基因异源表达，从而提高花生的经济价值。
[0011]优选地，将质粒pCAMBIA3300
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RJ39
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RS
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Tnos转化到农杆菌感受态LBA4404时，采用液氮冻融法。所述质粒pCAMBIA3300
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RJ39
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RS
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Tnos为把克隆的RS基因置于草莓果实特异性启动子RJ39的调控下,用除草剂抗性基因(bar)做选择标记构建而来。
[0012]优选地，所述花生为花生品种鲁花18号。
[0013]进一步地，采用液氮冻融法进行转化时，先液氮冻2min，再37℃孵育5min。
[0014]优选地，所述含Rif，Sm和Kan的培养基为含50mg/L Rif，100mg/L Sm和100mg/L Kan的液体CYM培养基。
[0015]优选地，农杆菌菌液侵染的时间为15
‑
30min。进一步地，农杆菌菌液侵染的时间为20min。
[0016]优选地，所述共培养采用暗培养的方式，时间为2
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4d。进一步地，所述共培养的时间为3d。
[0017]优选地，分化培养至生苗高1.5
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2.5cm后再转到的生根培养基进行生根培养。进一步地，分化培养至生苗高2cm后再转到的生根培养基进行生根培养。
[0018]优选地，所述生根培养为培养至形成不定根。时间大概需要5周左右。
[0019]优选地，还包括对生根花生苗进行鉴定的步骤。
[0020]进一步地，鉴定采用PCR法，PCR所采用的引物如SED ID NO；1和SED ID NO；2所示。
[0021]具体地，PCR的反应体系(20μL)为：模板DNA1μL；引物RS
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F1μL；引物RS
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R1μL；10
×
buffer 2μL；dNTPs(2.5mmol/L)2μL；Taq DNA聚合酶(10000U/mL)0.2μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；然后72℃再延伸10min。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术公开了一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，利用农杆菌侵染法将川鄂爬山虎白藜芦醇合成酶RS基因全长序列(1179bp)转化花生，经PCR、Southern印记杂交、Northern杂交等分子生物学检测，证明白藜芦醇合成酶基因RS已整合到花生的基因组中。本专利技术利用转基因技术提高花生中的RS含量，在改善花生抗性的同时促进下游产物白藜芦醇的含量增加，为研究RS基因代谢产物的生物学功能及调控机制提供了理论基础，为改良物种抗性和提高代谢物产量提供了一种有效途径。
附图说明
[0024]图1为pCAMBIA3300
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将质粒pCAMBIA3300
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RJ39
‑
RS
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Tnos转化到农杆菌感受态LBA4404中，并将筛选的阳性菌落在含Rif，Sm和Kan的培养基中培养至对数生长期，制得农杆菌菌液；S2、将花生无菌苗叶片切成小片，然后用步骤S1的农杆菌菌液进行侵染，侵染后放入MS0培养基中共培养，再转移到再生培养基上进行分化培养，分化培养后再转移到生根培养基上进行生根培养，最后将生根花生苗移栽至温室培养。2.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，其特征在于，将质粒pCAMBIA3300
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RJ39
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RS
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Tnos转化到农杆菌感受态LBA4404时，采用液氮冻融法。3.根据权利要求2所述的一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建方法，其特征在于，采用液氮冻融法进行转化时，先液氮冻2min，再37℃孵育5min。4.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇合酶基因转化花生体系的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜娟，胡玲，杨林，王亮，杨东生，胡文忠，
申请(专利权)人：珠海科技学院，
类型：发明
国别省市：