一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用技术

本申请涉及一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用，采用双层平板法检测滤液中PP7的滴度，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：；上式中，V

【技术实现步骤摘要】
一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用


[0001]本申请涉及膜过滤的领域，尤其是涉及一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]生物制剂往往采用人畜来源的原料制备，如亲本细胞、转化细胞、转基因动物产生的奶类、天然提取物和人畜来源的血浆等。这些产品一般属于蛋白质类，需要经过复杂的工序加工得到，在这些复杂的加工工序中，病毒污染是严重影响其安全性的因素，而如何提高生物制剂的安全性是各类生物、医药企业始终关注的问题。
[0003]2020年版《中国药典》和指导文件“ICH Q5A”对于生物制剂的病毒安全性有明确要求，生物制剂的病毒去除步骤已经必不可少。例如，在进行药品申报时，需要将病毒安全性评估测试结果形成报告附于申请文件中，以供审查。生产工艺中清除感染性病毒的能力，也就成为重要的评价标准。一般来说，生产过程中需要进行病毒灭活和/或病毒清除工序，目前较为常用的病毒清除方法是膜过滤除病毒，过滤器（过滤膜）的除病毒能力直接决定了生物制剂的病毒安全性。
[0004]膜分离技术是以膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力时（可以是压差、浓差等），原料侧组分选择性透过膜，从而达到分离、提纯和浓缩的目的。膜分离技术由于操作条件较为温和，不易引起生物制剂活性的改变；病毒分离效果好；能够直接放大应用于规模化的分离工程等原因，特别适合生物制剂的病毒清除步骤，因而广泛应用于生物、医药领域。
[0005]其中，除菌级过滤器的挑战测试方法可以参照ASTM F838
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20中的相关规定。而除病毒级过滤器目前并无明确的工业标准，不同企业的病毒挑战测试条件也存在一定的区别。针对上述问题，美国注射剂协会PDA(Parenteral Drug Association)就生物制剂的病毒过滤测试方法和除病毒验证发布了一份指南性文件“Virus Filtration, Technical Report No. 41(Revised 2008)”，简称TR41。
[0006]TR41文件中规定了，截留病毒为噬菌体PR772或PP7（PR772为大病毒，PP7为小病毒，可按需选择），物料流为免疫球蛋白IVIG（或牛血清蛋白BSA）。更进一步的，TR41的附录III中明确记载了小型病毒
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截留过滤器
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测试协议，其以PP7作为标称用的挑战病毒模型，蛋白透过率评估采用人免疫球蛋白（IVIG），为了计算病毒的截留率，需要对挑战液和滤液的PP7滴度分别进行检测。TR41中明确记载了PP7滴度的检测方法，其使用双层平板计数法对样品进行培养计数，检测体系的具体配方为1mL特定浓度的含有PP7的滤液样品和2mL宿主细胞（铜绿假单胞杆菌），以及9mL温热的琼脂；或含有PP7的滤液样品约0.1mL，宿主菌为1mL，琼脂液为4.5mL。
[0007]本申请的专利技术人们发现，检测挑战液中PP7的滴度时，直接参照TR41的方法即可，这是由于挑战液中PP7的滴度较高，通过控制合适的稀释度，平板上的可视菌斑数往往能够较好的控制在10~300pfu，根据稀释度、样品量以及噬菌斑数量即可计算挑战液中的PP7浓度（pfu/mL），检测结果的准确性高、平板上噬菌斑易于计数。
[0008]但是滤液中的PP7滴度较低（目前实际滴度比TR41中预期的要低），这是由于，TR41中规定，预过滤后挑战液中PP7的浓度106~107pfu/ml，并且要求过滤器（过滤膜）能够达到LRV4；然而，目前的过滤器（过滤膜）已经能够达到LRV＞5甚至LRV＞6，因此，最终得到的滤液的滴度比TR41中预估的低至少1~2个数量级。例如，若预过滤后的挑战液中PP7的滴度为106pfu/ml，当LRV=4时，滤液的滴度能够达到102pfu/ml，滴度较高；而当LRV=5时，滤液的滴度仅能达到101pfu/ml，有数量级的降低。在本申请中，当LRV＞5时，我们认为滤液中PP7的滴度超低（TR41要求计数10~300个噬菌斑的平板，而LRV＞5时已经有可能无法达到此要求，故认为滴度超低），很可能无法达到TR41中检测方法的检测限。
[0009]对于LRV4级别的滤膜而言，滤液中PP7滴度检测的方法可直接参考TR41，并不需要过多考虑滤液的检测量问题，这是由于滤液中的PP7滴度较高（甚至可能高达103以上），只需以不同的稀释度对滤液进行稀释，即可得到符合TR41中检测方法检测限的合适稀释度的滤液。而对于LRV5甚至LRV6以上滤膜的滤液而言，即使不进行任何稀释，滤液中PP7的滴度也可能无法达到TR41中检测方法的检测限，若仍然按照TR41中的规定的检测量（约0.1mL或1mL的检测量）进行取样，由于无法达到检测限，检测结果往往与真实值之间存在较大的偏差，准确性较低。
[0010]实际上，对于超低病毒滴度的滤液，TR41中的相关检测方法已经无法满足需求，需要对检测方法进行调整，其中，如何定量确定滤液的总检测量，确保检测结果与真实值之间偏差较小，检测结果准确性较高，是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0011]为了改善目前PDA发布的指导性文件TR41中病毒滴度的检测方法不适用超低病毒滴度滤液滴度检测的问题，本申请提供一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用，该检测方法通过限定PP7滤液样品的总检测量和滤液总量之间的关系，能够根据滤液总量定量的确定滤液的总检测量，以确保超低病毒滴度滤液的滴度检测结果具有较高的准确性，对于超低病毒滴度滤液滴度检测具有重要的指导意义。
[0012]本申请提供的一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用采用如下的技术方案：第一方面，本申请提供一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，采用如下的技术方案：一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，采用双层平板法，检测滤液中PP7的滴度，其中，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：；上式中，V
检
为样品滴度检测时，含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；V
总
为滤液的体积总量，400≥V
总
≥80；k为取样系数，0.5≥k≥0.075；b为取样修正系数，当V
总
＜180时，0≥b≥
‑
1；当250＞V
总
≥180时，2≥b≥0；当V
总
≥250时，3≥b≥0。
[0013]优选的，k≥0.1。更优选的，k≥0.15。
[0014]通过采用上述技术方案，需要明确的是，对于本申请而言，滤液中PP7滴度的真实值，是指以总检测量为V
检
+5时测得的滴度，且测得的滴度与总检测量为V
检
时测得的滴度的偏差应当在30%以内，若两者偏差高于30%，则认为总检测量V
检
不合理。对于超低滴度的滤液而言，即使是完全相同的检测方法，测得的结果也存在一定偏差，且随着滴度的降低，这种偏差有增大的趋势，因此，在认定检测结果的准确性时，需本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用双层平板法，检测滤液中PP7的滴度，其中，含有PP7的滤液样品的总检测量由下式计算得到：；上式中，V
检
为样品滴度检测时，含有PP7的滤液样品的总检测量，单位为mL；V
总
为滤液的体积总量，400≥V
总
≥80；k为取样系数，0.5≥k≥0.075；b为取样修正系数，当V
总
＜180时，0≥b≥
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1；当250＞V
总
≥180时，2≥b≥0；当V
总
≥250时，3≥b≥0。2.根据权利要求1所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：检测滤液中PP7的滴度时，以双层平板法检测取得的含有PP7的滤液样品的滴度，含有PP7的滤液样品的单次检测量V
单
满足下式：；上式中，S
板
为培养皿的底面积；h为检测体系在培养皿中的高度，h≤23mm；P为体积系数，4≥P≥2。3.根据权利要求1或2所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：检测滤液中PP7的滴度时，检测体系包括含有PP7的滤液样品、宿主菌液和琼脂液，且各组分的体积份数如下：含有PP7的滤液样品
ꢀꢀ
5~10mL；宿主菌液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2~8mL；琼脂液
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4~17mL；所述检测体系凝固后的强度为（30~150）g/cm2。4.根据权利要求3所述的超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法，其特征在于：所述检测体系凝固...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾建东，邵丹丹，
申请(专利权)人：杭州纽创生物检测有限公司，
类型：发明
国别省市：