猴痘病毒特异性检测靶标及其寡核苷酸和试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及猴痘病毒的特异性检测靶标，以及用于检测猴痘病毒的寡核苷酸、试剂盒和方法，包括针对猴痘病毒基因组中F3L基因区域设计特异性的引物及探针，在快速提取样本中的核酸后采用荧光PCR技术检测猴痘病毒核酸；本发明专利技术操作简单，采用TaqMan探针检测猴痘病毒靶基因，能特异性区分序列相似度很高的牛痘病毒。可以避免误检与漏检。可以避免误检与漏检。可以避免误检与漏检。

【技术实现步骤摘要】
猴痘病毒特异性检测靶标及其寡核苷酸和试剂盒


[0001]本专利技术属于生命科学和生物
，特别涉及一种猴痘病毒的特异性检测靶标、一种用于检测猴痘病毒的寡核苷酸、方法和试剂盒，采用荧光PCR技术，用于检测临床样本中的猴痘病毒核酸。

技术介绍

[0002]猴痘病毒(Monkeypox virus)与人类历史上曾肆虐数千年的天花病毒是“近亲”。猴痘病毒于1958年被首次发现，当时一组用于研究的猴子中出现“痘状”传染病，因此得名。自世界卫生组织1980年宣布人类彻底消灭天花以来，猴痘病毒已成为对公共卫生影响最大的正痘病毒。自2022年5月13日以来，全球之前未流行猴痘病毒的国家报告了92例确诊病例和28例疑似病例，未来有可能在这些国家及其他国家发现更多病例。目前，猴痘的确诊和疑似病例主要来自英国、西班牙和葡萄牙，其余分布在澳大利亚、比利时、加拿大、法国、德国、意大利、荷兰、瑞典和美国。
[0003]猴痘病毒属于痘病毒科、正痘病毒属。痘病毒是所有动物病毒中构造最大且最复杂的一群病毒，种类较多，都是结构较为复杂的DNA病毒。痘病毒依血清反应及形成方式分为六个亚属，正痘病毒属是痘病毒的第一亚属。在正痘病毒属家族中只有天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒和猴痘病毒四种可以引起人类感染，它们都含有可溶性的抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原性质基本相同，彼此之间有交叉免疫性。
[0004]猴痘病毒的形态与正痘病毒一致，外形为圆角砖形或卵圆形，大小200
‑‑
300nnl。外周是30nm的外膜，环绕匀质的核心体。猴痘病毒的基因组是双链DNA，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的6379bp末端反向重复序列。该病毒含190个开放阅读框(≥60个氨基酸)，其中4个位于末端反向重复序列中。基因组的GC含量很低，约含33％，基因组可编码病毒复制时所需的多种酶类，故病毒可独立进行复制。
[0005]由猴痘病毒引起的猴痘是一种罕见的人畜共患病。人类猴痘流行有一些特征，主要发生于非洲，多见于热带雨林、居民稀少的地区。全年散发，6
‑
8月份为发病高峰期，与降雨量大与人群户外活动增加有关。此外，猴痘流行的最重要的一个特征是人与入之间的传播十分罕见。
[0006]该病主要通过动物传播，人类可以因为被感染动物的咬伤或者直接接触感染动物的血液、体液和皮疹而感染猴痘。此外该病毒也可通过人与人传播，主要是通过长期的、直接的面对面接触时的呼吸道飞沫传播；另外，猴痘还可以通过直接接触猴痘病人的体液或者被污染的物品而传播。所有年龄组都可能感染此病，但没有预防接种的儿童死亡的危险性很高，大概有10％的病死率。
[0007]目前实验室诊断猴痘病毒的方法分为三类，第一类是培养分离的方法，通过细胞培养，然后分离出猴痘病毒；第二类是电镜检查，检测待检样本中是否有与正痘病毒形态一致的病毒存在；第三类是分子诊断的方法，采用荧光PCR方法特异性检测待检样本中的猴痘病毒核酸。然而，培养分离法虽然结果准确，但检测周期太长，容易出现假阴性结果，而且由
于进行活病毒操作，对实验室生物安全要求极高；电镜检查方法灵敏度不高，样本准备复杂周期长，而且电镜昂贵且操作及其复杂，不适合大范围推广；分子诊断法灵敏度高，特异性强，采用分子检测手段确定病毒是否存在具有很大优势。然而，目前市面上检测猴痘病毒的核酸产品仍然比较少，而且鉴于当前在一些国家传播的猴痘病毒毒株与之前主要在非洲传播的猴痘病毒毒株存在一些分子上的差别，仅根据早前在非洲传播的猴痘病毒毒株开发分子检测产品有可能出现漏检。此外，鉴于正痘病毒属的不同病毒成员存在较高的亲缘关系，现有的一些分子产品有可能出现交叉反应的现象。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供一种用于检测猴痘病毒的方法、寡核苷酸和试剂盒，选择了猴痘病毒基因组中的保守性DNA片段(比如F3L基因中的保守性区域)设计第一引物对和第一探针，同时引入针对人体内参基因(比如人RNaseP)的第二引物对和第二探针，可以有效地避免检测临床样本时遇到的假阴性。这种针对猴痘病毒的检测体系可以有效避免猴痘病毒漏检的问题。
[0009]在本专利技术中，位于每条探针5
’
端的x1、x2为荧光报告基团，位于每条探针3
’
端的y1、y2为发出荧光或不发出荧光的淬灭基团。优选地，第一探针的3
’
端还含有MGB分子。在本专利技术中，荧光报告基因可选自FAM、VIC、HEX、ROX、Cy5、Cy5.5等其中的一种，淬灭基团可以选择TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2或BHQ3)、QSY、NFQ等其中的一种。
[0010]本专利技术中的第一探针和第二探针的荧光报告基因和淬灭基团以诸如“FAM
‑
TARMA/BHQ”或“VIC/HEX/JOE
‑
TAMRA/BHQ”之类的形式给出，
“‑”
左边的表示荧光报告基团，
“‑”
右边的表示淬灭基团。FAM
‑
TARMA/BHQ表示同一条探针的荧光报告基因为FAM，淬灭基团可选自TARMA或BHQ。VIC/HEX/JOE
‑
TAMRA/BHQ表示同一条探针的荧光报告基因可选自VIC、HEX或JOE，淬灭基团可选自TAMRA或BHQ。FAM
‑
MGBNFQ表示同一条探针的荧光报告基因选自FAM，淬灭基团选自NFQ，与此同时该探针的3
’
端还含有MGB分子。VIC/HEX/JOE
‑
MGBNFQ表示同一条探针的荧光报告基因选自VIC、HEX和JOE中的一种，淬灭基团选自NFQ，与此同时该探针的3
’
端还含有MGB分子。
[0011]本专利技术提供猴痘病毒基因组中的保守性DNA片段，所述保守性DNA片段的序列为SEQ ID NO:7或其互补序列。
[0012]本专利技术还提供用于检测猴痘病毒的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括用于检测猴痘病毒基因组中保守性DNA片段的第一引物对和第一探针。优选地，所述保守性DNA片段是猴痘病毒特异性的，也就是该DNA片段是猴痘病毒特有的。
[0013]进一步地，所述寡核苷酸还包括用于检测内参基因的第二引物对和第二探针。
[0014]进一步地，所述保守性DNA片段来自猴痘病毒基因J1L，J2L，J3L，D1L，D2L，D3R，D4L，D5R，D6L，D7L，D8L，D9L，D10L，D11L，D12L，D13L,D14L,D15L,D16L,D17L,D18L,D19L，P1L,P2L,O1L,O2L,C1L,C2L,C3L,C4L,C5L,C6R,C7L,C8L,C9L,C10L,C11L,C12L,C13L,C14L,C15L,C16L,C17L,C18L,C19L,C20L,C21L,C22L,C23R，F1L,F2L,F3L,F4L,F5R,F6R,F7R,F8L,F9R,F10L，Q1L,Q2L,I1L,I2L,I3L,I4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒的特异性检测靶标，其特征在于，所述检测靶标的序列为SEQ ID NO:7或其互补序列。2.用于检测猴痘病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸至少包括：用于检测猴痘病毒基因组保守性DNA片段的第一引物对和第一探针。3.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸还包括用于检测一种内参基因的第二引物对和第二探针。4.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述保守性DNA片段来自F3L基因。5.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述保守性DNA片段的序列为SEQ ID NO:7或其互补序列。6.如权利要求2所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第一引物对和第一探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～3。7.如权利要求3所示的寡核苷酸，其特征在于，所述第二引物对和第二探针的碱基序列分别为SEQ ID NO:4～6。8.如权利要求3所示的寡核苷酸，其特征在于，第一探针的荧光报告基团和淬灭基团选自FAM
‑
TARMA/BHQ、VIC/HEX/JOE
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TAMRA/BHQ、FAM
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【专利技术属性】
技术研发人员：张太松，焦明超，陈斐斐，刘学锋，
申请(专利权)人：艾康生物技术杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：