扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对及其应用。属于分子生物学技术领域。用于扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对，其核苷酸序列如下：上游引物FCoV

【技术实现步骤摘要】
扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，更具体的说是涉及扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对及其应用。

技术介绍

[0002]猫冠状病毒(Feline Coronavirus，FCoV)是引起猫冠状病毒病的主要病原，具有两种生物型，分别为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。FECV主要感染肠道细胞，通常无症状或引起轻微的肠道症状，如腹泻、呕吐等，偶尔引起严重的肠炎，致死率较低。而FIPV的感染，则可导致猫腹膜急性、烈性的炎症反应，致死率极高。研究发现，FCoV在猫群中普遍流行，且传播能力强，感染率高，在多猫家庭或流浪猫收容所等卫生条件相对较差的环境中较为多发，严重威胁猫的健康。
[0003]FCoV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员，是有囊膜的单链正股RNA病毒，全长29Kb左右，具有典型的冠状病毒基因组结构，包括11个开放阅读框，分别编码4个结构蛋白(S、E、M、N)、2个非结构蛋白(1a和1b)和5个辅助蛋白(3a、3b、3c、7a和7b)。其中，E蛋白，即包膜蛋白，具有可溶性的完整膜蛋白，其包装RNA基因组形成核衣壳，在病毒的脱壳、组装和释放过程中起着重要作用。M蛋白，即膜糖蛋，是病毒粒子被膜中含量最丰富的蛋白，它决定了病毒包膜的形状，并通过与其他结构蛋白的相互作用来指导组装过程，也被认为是冠状病毒组装的中心组织者，与所有其他主要冠状病毒结构蛋白相互作用。N蛋白，即核衣壳蛋白，是唯一一种主要与冠状病毒RNA基因组结合，构成核衣壳的蛋白质，主要功能是将病毒RNA包装成螺旋状核糖核衣壳(RNP)，并在病毒粒子组装过程中与其他结构蛋白相互作用，把基因组包裹保护起来。这三个结构蛋白都与冠状病毒的结构、组成有着密不可分的联系，并在一定程度上决定病毒的致病性，是FCoV致病作用的主要成分。因此了解、掌握FCoV编码E、M、N蛋白的E、M、N基因的变异情况，有助于了解FCoV的基因重组、抗原变异、病毒感染细胞机制和基因变化规律，对FCoV致病机制的研究和疫苗等防控措施开发均有重要的指导意义。
[0004]目前，FCoV的E、M、N基因的全序列的获得主要通过设计三对针对猫冠状病毒E、M、N全长基因的引物，分别对这三个基因进行扩增、测序和/或拼接，从而获得E、M、N基因的全长片段。该方法不仅存在“工作量大”“耗时长”等问题，还因为E、M、N基因在基因组中相互毗邻，存在重复工作的问题。此外，FCoV作为一种基因组较大的RNA病毒，不同毒株之间的E、M、N基因存在着一定程度的变异，从而导致该方法在不同毒株之间存在“无法成功扩增获得目的片段”的风险。
[0005]综上，如何提供一种猫冠状病毒E、M、N基因全序列一步扩增方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对及其应用。猫
冠状病毒为一种基因组比较大的RNA病毒，比较容易发生变异。本专利技术主要通过寻找E、M、N三个基因上下游保守序列，设计引物，并对PCR程序进行了优化。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一组扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对，其核苷酸序列如下：
[0009]上游引物FCoV
‑
EMN1：TYTTCTCAGGCGGTTMTA；SEQ ID NO:1；
[0010]其中，Y为C或T，M为A或C；
[0011]下游引物FCoV
‑
EMN2：CAAGGCAGTCTGGTTTCA；SEQ ID NO:2。
[0012]进一步的，上游引物FCoV
‑
EMN1的核苷酸序列为下列任一一个：
[0013]TTTTCTCAGGCGGTTATA；SEQ ID NO:3；
[0014]TTTTCTCAGGCGGTTCTA；SEQ ID NO:4；
[0015]TCTTCTCAGGCGGTTATA；SEQ ID NO:5；
[0016]TCTTCTCAGGCGGTTCTA；SEQ ID NO:6。
[0017]一种扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的试剂盒，包括上述的引物对。
[0018]一种猫冠状病毒E、M、N基因全序列一步扩增方法，包括如下步骤：
[0019](1)提取病毒RNA；
[0020](2)cDNA合成；
[0021](3)使用上述引物对进行PCR扩增；
[0022](4)基因片段检测及测序。
[0023]进一步的，步骤(1)中采用Trizol试剂法提取病毒RNA。
[0024]进一步的，步骤(2)中采用1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)试剂盒对提取的病毒RNA进行反转录，获得cDNA。
[0025]进一步的，步骤(3)中PCR扩增反应体系为：
[0026][0027]其中，上游引物FCoV
‑
EMN1、下游引物FCoV
‑
EMN2的浓度为10pmol/μL。
[0028]进一步的，步骤(3)中PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸5min，设置35个循环；72℃终延伸10min。
[0029]进一步的，测序前，采用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒对基因片段进行纯化。
[0030]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：本专利技术通过一步扩增法，无需多次扩增、裁剪，仅需通过一次PCR扩增即可实现猫冠状病毒E、M、N全基因的扩增，操作简便快捷，避免单个基因扩增的重复性，并且增加了基因扩增的保真性。同时，因设计的引物位于E、M、N三个基因上下游保守区域，有效克服因基因变异导致的无法成功扩增获得目的片段的风险。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0032]图1附图为本专利技术猫冠状病毒E、M、N基因全序列的PCR扩增结果，其中，M：DL5000Plus DNA Marker；1
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9：泳道1为实施例2中BQ08，2
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3月龄中华田园猫粪便样品结果，泳道2为实施例3中BD22，3月龄蓝白猫粪便样品结果，泳道3为实施例4中BS78，3月龄蓝猫粪便样品结果，泳道4
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9：其他来源的FCoV阳性粪便样品；10：阳性对照(以之前用该引物已经扩增获得目的条带样品核酸作为模板)；11：阴性对照(用ddH2O作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的引物对，其特征在于，其核苷酸序列如下：上游引物FCoV
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EMN1：TYTTCTCAGGCGGTTMTA；SEQ ID NO:1；其中，Y为C或T，M为A或C；下游引物FCoV
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EMN2：CAAGGCAGTCTGGTTTCA；SEQ ID NO:2。2.一种扩增猫冠状病毒E、M、N基因全序列的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。3.一种猫冠状病毒E、M、N基因全序列一步扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翠琴，包银莉，郑灿阳，许洵锴，陈秋，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：