一种“金蚕花”抗炎活性多糖的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种“金蚕花”抗炎活性多糖的制备方法及应用。“金蚕花”粉经丙酮

【技术实现步骤摘要】
一种“金蚕花”抗炎活性多糖的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及了一种中药材中提取多糖的制备方法及应用，尤其是涉及一种“金蚕花”抗炎活性多糖的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]多糖(polysaccharide)是由单糖聚合而成并且聚合度大于10的极性复杂大分子，分子量一般为数万甚至数百万。多糖是继蛋白质、核酸之后，又一携带大量生物信息的生物大分子，来源于真菌、藻类地衣、植物、细菌、动物等。药理和临床研究结果表明，天然多糖具有抗癌、抗炎、降血糖、增强体质等作用，而且毒副作用小，受到人们越来越广泛的重视。
[0003]蝉花(Cordyceps cicadae)为麦角菌科真菌大蝉草的无性型蝉拟青霉寄生蝉类若虫体后所产生的子座与若虫尸体的菌虫复合体，又名蝉草、蝉茸、胡蝉、金蝉花等，是我国一味传统的名贵中药材。由于自然界中野生蝉花资源日趋枯竭,人工培养蝉花越来越显得必要。

技术实现思路

[0004]为了解决
技术介绍
中的问题，本专利技术提供了一种“金蚕花”抗炎活性多糖的制备方法及应用，采用回流提取、DEAE
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Sepharose Fast Flow离子交换层析柱分离以及Sephacryl S
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300层析柱和Sephacryl S
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400层析柱纯化的方法，制备得到了“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP，“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP是专利技术人从“金蚕花”中分离提取的一种新型抗炎活性多糖，其分子量为2.26
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104Da，将其命名为JNIP。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一、一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法：
[0007]1)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；
[0008]2)“金蚕花”粉依次进行脱脂和除去苷类处理；
[0009]3)脱脂和除去苷类处理后的“金蚕花”粉，用超声波辅助双蒸馏水回流获得粗多糖液；
[0010]4)粗多糖液除蛋白后，用乙醇沉淀获得多糖；
[0011]5)对多糖进行连续多次层析柱洗脱处理，进而获得纯化物，从而得到“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP。
[0012]具体实施后对纯化物用Waters 1525型高效液相色谱系统检测，为均一的多糖组分，取名JNIP。
[0013]所述的“金蚕花”是本专利技术申请将蝉拟青霉ST168感染药食同源的蚕蛹，经人工培养而成的中药材蝉花代用品。但“金蚕花”的药用机理特别是抗炎机理还不清楚，这阻害了“金蚕花”作为蝉花代用品的开发应用。制备“金蚕花”抗炎活性多糖并应用于抗炎药物开发，对于推进“金蚕花”作为蝉花代用品的开发应用以及提升蚕桑产业，均具有积极的社会效益和经济效益。
[0014]所述步骤1)具体为：将“金蚕花”于
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50℃下真空干燥36h，于
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15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到“金蚕花”粉。
[0015]所述步骤2)具体为：取“金蚕花”粉，按W：V为1：3加入丙酮
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石油醚混合液，丙酮
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石油醚混合液中丙酮与石油醚体积比为1:1，在60℃下回流脱脂1h且重复2次，再抽滤，残渣用5倍体积质量浓度为70％乙醇在85℃下回流1h除去苷类且重复3次，再抽滤，残渣于40℃烘干。
[0016]所述步骤3)具体为：烘干残渣按W：V为1：25加入双蒸馏水，超声波处理30～35min后，于85℃下提取1.5～2.0h，用抽滤机进行抽滤处理，取滤液用高速离心机于9000rpm下离心5min，收集上清液用旋转蒸发仪浓缩后，
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50℃下真空干燥，得到粗多糖，将粗多糖按W：V为1：10加入双蒸馏水溶解获得粗多糖液。
[0017]所述步骤4)具体为：针对粗多糖液，用体积比为4:1的氯仿与正丁醇除蛋白至碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，接着于50℃下旋蒸以除去氯仿与正丁醇，加入质量浓度为100％的乙醇，使乙醇质量浓度达到70％，充分搅拌后置冰箱过夜，沉淀得到多糖。
[0018]所述步骤5)具体为：
[0019]5.1)多糖用去离子水溶解，再离心取上清液，上清液过滤膜后上DEAE
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Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到中性多糖组分；
[0020]5.2)中性多糖组分用去离子水溶解，过滤膜后上Sephacryl S
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300层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱峰的洗脱液，浓缩后得到多糖浓缩液；
[0021]5.3)多糖浓缩液过滤膜后上Sephacryl S
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400层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥得到干燥纯化物。
[0022]所述步骤5)具体为：
[0023]5.1)多糖用去离子水溶解配制成20mg/mL溶液，9000rpm离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上DEAE
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Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用去离子水以3.2～3.4mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚
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硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，
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50℃下真空干燥，得到中性多糖组分；
[0024]5.2)中性多糖组分用去离子水溶解配制成浓度为10mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜，上Sephacryl S
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300层析柱，用去离子水以0.8～1.0mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚
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硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩，得到浓度为10mg/mL的多糖浓缩液；
[0025]5.3)多糖浓缩液过0.45μm滤膜，上Sephacryl S
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400层析柱，用去离子水以0.8～1.0mL/min流速洗脱，自动收集器收集，苯酚
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硫酸法检测，收集有显色反应的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，
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50℃下真空干燥得到干燥纯化物。
[0026]具体实施中，采用配有TOSOH BIOSEP G4000糖分析柱的Waters 1525型高效液相色谱系统，以Waters 2414示差折光检测器检测干燥纯化物，呈现单一对称峰，对照标准曲线计算分子量为2.26
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104Da，为均一的多糖组分，取名JNIP。
[0027]二、一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP，采用上述制备方法制备而成。
[0028]三、一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的应用，用于制备抗炎药物。
[0029]所述抗炎药物为抗击脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症的药
物。
[0030]本专利技术具有的有益效果是：
[0031]本专利技术制备的“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP，纯度均一，分子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：1)将“金蚕花”处理获得“金蚕花”粉；2)“金蚕花”粉依次进行脱脂和除去苷类处理；3)脱脂和除去苷类处理后的“金蚕花”粉，用超声波辅助双蒸馏水回流获得粗多糖液；4)粗多糖液除蛋白后，用乙醇沉淀获得多糖；5)对多糖进行连续多次层析柱洗脱处理，进而获得纯化物，从而得到“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP。2.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：将“金蚕花”于
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50℃下真空干燥36h，于
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15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到“金蚕花”粉。3.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：取“金蚕花”粉，按W：V为1：3加入丙酮
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石油醚混合液，丙酮
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石油醚混合液中丙酮与石油醚体积比为1:1，在60℃下回流脱脂1h且重复2次，再抽滤，残渣用5倍体积质量浓度为70％乙醇在85℃下回流1h除去苷类且重复3次，再抽滤，残渣于40℃烘干。4.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：所述步骤3)具体为：烘干残渣按W：V为1：25加入双蒸馏水，超声波处理30～35min后，于85℃下提取1.5～2.0h，用抽滤机进行抽滤处理，取滤液用高速离心机于9000rpm下离心5min，收集上清液用旋转蒸发仪浓缩后，
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50℃下真空干燥，得到粗多糖，将粗多糖按W：V为1：10加入双蒸馏水溶解获得粗多糖液。5.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：所述步骤4)具体为：针对粗多糖液，用体积比为4:1的氯仿与正丁醇除蛋白至碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，接着于50℃下旋蒸以除去氯仿与正丁醇，加入质量浓度为100％的乙醇，使乙醇质量浓度达到70％，充分搅拌后置冰箱过夜，沉淀得到多糖。6.根据权利要求1所述的一种“金蚕花”抗炎活性多糖JNIP的制备方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：5.1)多糖用去离子水溶解，再离心取上清液，上清液过滤膜后上DEAE
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Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：时连根，李文乐，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：