试剂盒和设备制造技术

本文提供了可以用于改进的多核苷酸检测的试剂盒和设备。的试剂盒和设备。的试剂盒和设备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】试剂盒和设备
[0001]本专利技术涉及适用于检测大量诊断标志物的存在，包括用于鉴定癌症、感染性疾病和移植器官排斥的那些标志物的存在的试剂盒设备。它们对于伴随诊断测试(companion diagnostic testing)也有用，在伴随诊断测试中，必须可靠和低成本地鉴定一组标志物。
[0002]聚合酶链式反应(PCR)是一种众所周知的强有力的技术，用于将实验室和诊断样品中存在的DNA或RNA扩增到可以被可靠检测和/或定量的程度。然而，当用于研究含有低水平的这样的分子的分析物样品时，它受到许多限制。首先，虽然该技术可以检测少至单个靶分子，但由于样品中存在的其他核酸序列的不希望的扩增，它容易产生假阳性结果。这使得选择用于启始反应的寡核苷酸引物成为关键；这继而使得设计具有所需特异性水平的引物变得相对复杂。因此，目前市场上许多基于PCR的测试具有有限的特异性。
[0003]第二个缺点是，基于PCR的方法的多路复用在实践中被限制在最多几十个靶序列(通常不超过10个)以避免引物
‑
引物相互作用，导致需要相对狭窄的操作窗口。
[0004]另一个问题是，由于PCR反应以指数方式循环，靶的定量很困难；反应效率的微小变化对生成的可检测物质的量有巨大影响。因此即使有适当的控制和适当的校准，定量通常限于3倍左右的精确度。
[0005]最后，通过PCR扩增方法进行研究的目标区域中的突变可能具有不必要的副作用。例如，有这样的实例，其中因为目标生物体在测试引物所靶向的遗传区域发生突变，导致大量假阴性，FDA批准的测试不得不撤销。相反，如果特定的单核苷酸多态性(SNP)是扩增的目标，那么当野生型变体存在时，PCR方法通常会产生假阳性。避免这种情况需要非常仔细的引物设计，并进一步限制了多路复用的功效。这在搜索SNP的组时尤其重要，因为这是癌症测试/筛查或伴随诊断的常见要求。
[0006]US2006/110765 A1(Wang等人)教导了在错配处的酶促裂解，这通常是低效且不是高度特异性的反应。此外，如在Wang等人中所公开的，因为在错配处使用裂解，探针与样品中相似序列的脱靶杂交会导致假阳性结果。也不可能区分相同或邻近位置上的两个不同的遗传变体，因为它们都将导致相同探针的裂解和扩增。因此，Wang等人的教导将导致反应方案的低灵敏度和低特异性。相比之下，本专利技术所公开的方法的技术效果提供了快速、高效的方法，对dsDNA具有高特异性，可以通过错配有效地被阻断。此外，本专利技术的方法对被靶向的遗传变体极其特异，能够在相同或邻近位置的不同变体之间进行区分。
[0007]US2009/239283 A1(Liu等人)教导了使用通过焦磷酸解去除的不可延伸的3'末端，使得能够去除3'封闭修饰的定制聚合酶的基因工程成为必要。相比之下，本专利技术利用了现有聚合酶固有的天然焦磷酸解活性，并且不使用3'封闭修饰。在Liu等人中公开的方法还依赖于从探针的一部分中仅移除末端碱基以实现后续的扩增，并且通过使用3'封闭修饰而限制于这个实施方案。相比之下，本专利技术公开的方法实现了这样的实施方案，其中需要从探针上逐步移除多于一个碱基来启动反应，使其对背景DNA或其他探针的瞬时脱靶退火实质上更鲁棒，背景DNA或其他探针的瞬时脱靶可能导致末端碱基的不必要的移除。

技术实现思路

[0008]我们现在已经开发了用于一种新方法的试剂盒和设备，该方法建立在使用我们早期专利(见PCT/GB2019/052017)中使用的焦磷酸解(pyrophosphorolysis)方法的经验基础上，以克服这些限制中的许多限制。为此，它利用了焦磷酸解(一种将不能在单链寡核苷酸底物或包含封闭基团或核苷酸错配的双链底物上有效进行的反应)的双链特异性。因此，根据本专利技术，提供了试剂盒，该试剂盒包括：
[0009](a)单链探针寡核苷酸A0，所述单链探针寡核苷酸A0能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物是至少部分双链的；
[0010](b)连接酶；
[0011](c)焦磷酸解酶，所述焦磷酸解酶能够从A0的末端在3
’‑5’
方向上消化所述第一中间产物以产生部分消化的链A1；
[0012](d)至少一种与A0的一部分基本上互补的单链引物寡核苷酸；
[0013](e)扩增酶；
[0014](f)合适的缓冲液。
[0015]以及设备，所述设备包括：
[0016]在第一区域、第二区域和第三区域之间的至少一个流体通道，其中所述第一区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包括：
[0017]dNTP；
[0018]至少一种单链引物寡核苷酸；
[0019]用于初始扩增样品中存在的DNA的扩增酶；和
[0020]其中所述第二区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包括：
[0021]单链探针寡核苷酸A0，单链探针寡核苷酸A0能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物是至少部分双链的；
[0022]焦磷酸解酶，所述焦磷酸解酶能够从A0的末端在3
’‑5’
方向上消化所述第一中间产物以产生部分消化的链A1；
[0023]至少一种焦磷酸根离子源；
[0024]连接酶；
[0025]和
[0026]其中所述第三区域包括一个或更多个孔，其中每个孔包含：
[0027]dNTP；
[0028]缓冲液；
[0029]扩增酶；
[0030]用于检测源自A1或其部分，或A1的多于一个拷贝或其部分的多于一个拷贝的信号的装置(means)；并且
[0031]其中所述第二区域的孔或所述第三区域的孔还包括至少一种与A0的一部分基本上互补的单链引物寡核苷酸。
[0032]可应用本专利技术的方法的分析物是包括被寻找的靶多核苷酸序列的那些核酸，诸如天然存在的或合成的DNA或RNA分子。在一种实施方案中，分析物通常存在于含有分析物和其他生物材料的水性溶液中，并且在一种实施方案中，分析物将与其他背景核酸分子一起
存在，这些背景核酸分子并不是测试目的所关注的。在一些实施方案中，相对于这些其他核酸组分，分析物将以低的量存在。优选地，例如，当分析物来源于含有细胞物质的生物样品时，在执行方法的步骤(b)之前，将使用样品制备技术诸如过滤、离心、色谱或电泳，除去一些或所有这些其他核酸和外来生物物质。合适地，分析物来源于取自哺乳动物受试者(尤其是人类患者)的生物样品，诸如血液、血浆、痰、尿液、皮肤或活组织检查。在一种实施方案中，将对生物样品进行裂解，以便通过破坏任何存在的细胞来释放分析物。在其他实施方案中，分析物可能已经以游离形式存在于样品本身中；例如在血液或血浆中循环的无细胞DNA。
[0033]附图简述
[0034]图1：用于简化的多核苷酸序列检测方法的方案。
[0035]图2：比较当5
’‑3’
核酸外切酶消化步骤发生在预扩增步骤期间和当它移到方案的焦磷酸解/连接步骤(如在方案3
‑
5中)时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种试剂盒，所述试剂盒包括：(a)单链探针寡核苷酸A0，所述单链探针寡核苷酸A0能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物是至少部分双链的；(b)连接酶；(c)焦磷酸解酶，所述焦磷酸解酶能够从A0的末端在3
’‑5’
方向上消化所述第一中间产物以产生部分消化的链A1；(d)驱动焦磷酸解反应的离子源，其中任选地所述离子为焦磷酸根离子；和(e)合适的缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照。3.根据任一前述权利要求所述的试剂盒，其中A0的5
’
末端被赋予对5
’‑3’
核酸外切酶消化的抗性，并且其中所述试剂盒还包括5
’‑3’
核酸外切酶。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、聚合酶和缓冲液，用于初始扩增存在于样品中的靶多核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括掺入dUTP的高保真聚合酶、dUTP和尿嘧啶
‑
DNA N
‑
糖基化酶(UDG)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括蛋白酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，还包括连接探针寡核苷酸C。8.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，还包括夹板寡核苷酸D。9.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，还包括连接探针寡核苷酸C和夹板寡核苷酸D。10.根据权利要求7或9所述的试剂盒，其中所述连接探针寡核苷酸C包含保护其免受3
’‑5’
核酸外切酶消化的3
’
修饰或内部修饰，并且所述试剂盒还包括3
’‑5’
核酸外切酶。11.根据权利要求8、9或10所述的试剂盒，其中D包含与A1的3
’
末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5
’
末端或A1的5
’
末端互补的区域。12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中由于3
’
修饰或通过D的3
’
末端和A1或C的相应区域之间的错配，D不能针对A1进行延伸。13.根据任一前述权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括至少一种与A0的一部分基本上互补的单链引物寡核苷酸、扩增酶、dNTP和一种或更多种寡核苷酸结合染料或分子探针。14.根据任一前述权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括多于一种A0，每种A0对不同的靶序列有选择性并且每种A0包含识别区。15.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：
‑
两个或更多个与A1上相邻序列互补的连接链式反应(LCR)探针寡核苷酸，其中当探针成功退火时，一个LCR探针的5
’
磷酸与另一个LCR探针的3
’
OH直接相邻；和
‑
一种或更多种连接酶。16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述扩增酶与所述焦磷酸解酶相同。17.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括
‑
连接探针寡核苷酸C；
‑
夹板寡核苷酸D；
其中C具有5
’
磷酸，夹板寡核苷酸D的3
’
末端与C的5
’
末端互补并且D的5
’
末端与A1的3
’
末端互补，使A1和C能够被连接在一起形成A2。18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：
‑
包含荧光团
‑
猝灭剂对的发夹寡核苷酸1(HO1)，其中HO1与A2互补，并且当与A2退火时，HO1的发夹结构打开并且所述荧光团
‑
猝灭剂对分离；和
‑
包含荧光团
‑
猝灭剂对的发夹寡核苷酸2(HO2)，其中HO2与打开的HO1互补，并且当与HO1退火时，HO2的发夹结构打开，并且所述荧光团
‑
猝灭剂对分离。19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括多于一个HO1和HO2。20.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：
‑
寡核苷酸A，所述寡核苷酸A包含底物臂、部分催化核心和传感器臂；
‑
寡核苷酸B，所述寡核苷酸B包含底物臂、部分催化核心和传感器臂；和
‑
包含荧光团
‑
猝灭剂对的底物；其中寡核苷酸A和寡核苷酸B的传感器臂与A2的侧翼区域互补，使得在A2的存在下，寡核苷酸A和寡核苷酸B组合形成催化的、多组分核酸酶(MNAzyme)。21.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括部分双链的核酸构建体，其中：
‑
一条链包含至少一个RNA碱基、至少一个荧光团，并且其中该链的区域与A2的区域互补，并且其中该链是“底物”链；和
‑
另一条链包含至少一个猝灭剂，并且其中该链的区域与A2的和所述底物链互补的区域相邻的区域互补，使得在A2的存在下，所述部分双链的核酸构建体具有更大的双链部分。22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于去除所述至少一个RNA碱基的酶。23.根据权利要求1至12中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：
‑
与A2的包含连接位点的区域互补的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括一个或多于一个荧光团，所述荧光团被排列成使得它们的荧光通过它们彼此接近或它们与一个或更多个荧光猝灭剂接近而猝灭；
‑
双链特异性DNA消化酶；其中，在A2的存在下，标记的寡核苷酸被消化，使得所述荧光团彼此分离或与其相应的猝灭剂分离，并且荧光信号，且因此A2的存在是可检测的。24.根据权利要求1至23中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括磷酸酶或磷酸水解酶。25.根据权利要求1至24中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括焦磷酸酶。26.根据权利要求1至25中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于从RNA模板形成DNA的酶。27.一种设备，所述设备包括：在第一区域和第二区域之间的流体通道，其中所述第一区域包括一个或更多个孔，其中一个或更多个孔包括：单链探针寡核苷酸A0，其能够与靶多核苷酸序列形成第一中间产物，所述中间产物是至...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡梅伦，
申请(专利权)人：生物保真有限公司，
类型：发明
国别省市：