一种核酸等温扩增方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸的恒温扩增方法及其应用。该方法中所用的逆转录酶、RNA聚合酶以及RNA酶H均为至少在45℃仍具有活性的耐热酶，并且所述扩增反应在不低于45℃的温度下恒温进行。本发明专利技术的恒温核酸扩增方法具有快速、恒温、灵敏度和特异性高的特点，适合临床检验等领域的核酸检测。领域的核酸检测。领域的核酸检测。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸等温扩增方法及其应用


[0001]本公开涉及一种新的核酸等温扩增检测技术，利用耐热的逆转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H三种酶的组合，优化了TMA/NASBA的反应体系，可以实现单一温度下对靶标RNA分子的扩增反应。本公开还涉及该核酸等温扩增检测技术在病原体检测方面的应用。

技术介绍

[0002]核酸检测是目前大多数疾病检测的金标准，例如流感病毒、冠状病毒等的诊断都需要核酸检测检测结果作为金标准判定。样本中的核酸分子一般浓度都较低，例如病毒轻度感染的患者，其样本中的核酸浓度可能只有1000
‑
3000copies/mL。所以核酸检测基本都是有扩增方法加检测方法组成。最为经典的分子检测方法就是PCR法，传统的PCR检测方法是PCR扩增，然后通过电泳或一代测序对PCR产物加以确认，若是需要对RNA进行检测，则在PCR的步骤中加入逆转录酶。这种方法因为效率低，且需要开管容易造成污染，所以目前已经不常用。
[0003]目前最为常用的PCR检测方法是荧光定量PCR法，在PCR反应中加入荧光探针或者荧光染料，使得扩增过程本身能产生实时的荧光信号，再通过对荧光信号的判定则可以实现对靶标的确认。荧光定量PCR法具有快速简单的特点，同时荧光定量PCR反应不需要开管取出扩增产物，污染风险也较小，荧光定量PCR已经成为分子检测的金标准方法。但荧光定量PCR本身也存在一些固有的短板，比如，荧光定量PCR需要依赖高精密的温度循环仪进行检测，对操作人员的要求也较高，且污染控制也较为严格，所以基于PCR的RNA检测局限于中心实验室，对于现场快速检测有很大的限制。
[0004]近年来发展出很多新的核酸等温扩增检测技术，例如1)环介导等温扩增技术(LAMP)可利用4对引物特异识别6个靶位点和具有链置换活性的DNA聚合酶，可在60
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65℃条件下实现核酸快速扩增和检测(一般小于1小时)；2)依赖于核酸序列的扩增(NASBA)法，利用三种酶(逆转录酶、RNA酶和T7 RNA聚合酶)和两个特异性引物的引导，在一恒定温度下温育45
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90分钟，即可完成对RNA模板的快速扩增，同时利用荧光基团标记的发夹型核酸探针进行检测；3)滚环扩增技术(RCA)，利用DNA连接酶和DNA聚合酶，以滚环复制的模式，从一条或多条引物处进行环形模板的链置换合成，从而可实现部分病毒的环状基因组的扩增；4)重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，是在由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，利用这三种酶的共同作用，实现在等温环境下的扩增。
[0005]以上几种技术都各有其内在缺陷，如LAMP法扩增一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，并且其引物设计要求比较高，对于分型或点突变检测常常不能满足要求；RPA方法的酶组分较为复杂，对于点突变的检测能力有限；RCA的反应时间偏长(>4小时)，使其在应用方面特别是现场检测中的优势不甚明显。NASBA/TMA方法为一种RNA扩增方法，优点是反应体系简单，但现有NASBA的缺点
是为了保证检测的灵敏度，需要进行一步温度较高的预变性(一般为60
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65℃)，扩增酶在此温度下会失活，需要在降温到41
‑
42℃时才能加入酶。这个步骤导致操作变得复杂，自动化程度低，不能做到真正的等温，但若取消预变性步骤，则扩增效率大幅降低，不能满足检测所需的高灵敏度。同时，NASBA目前常用探针法检测，探针法需要实时进行荧光信号的读取，对荧光检测仪的资源占用较大，导致检测通量难以提高。

技术实现思路

[0006]为了解决NASBA/TMA技术的痛点，我们开发了一种高温TMA方法
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Hi
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TMA技术，利用三种酶即转录酶/逆转录酶/RNA酶H的高温的组合，实现了例如在47
‑
51℃温度下的等温扩增，且扩增效率相比传统的NASBA大幅提高。同时，该方法可以搭配CRISPR/Cas13检测技术，使得该方法采用终点法进行检测也可以实现精准的检测特异性，提升了检测效率和检测通量。
[0007]因此，在一方面，本文提供了一种改进的NASBA/TMA核酸恒温扩增方法，其中逆转录酶、RNA聚合酶以及RNA酶H均为至少在45℃仍具有活性的耐热酶，并且所述扩增反应在不低于45℃的温度下恒温进行。
[0008]在一些实施方案中，所述逆转录酶、RNA聚合酶以及RNA酶H均为至少在51℃仍具有活性的耐热酶，并且所述扩增反应在47℃
‑
51℃的温度下恒温进行。
[0009]在一些实施方案中，所述扩增反应无需预变性步骤。
[0010]在一些实施方案中，所述核酸包括DNA和/或RNA。
[0011]在一些实施方案中，所述逆转录酶为AMV逆转录酶或MMLV逆转录酶。
[0012]在一些实施方案中，所述RNA聚合酶为耐热型T7、T3、M13、或SP6 RNA聚合酶。
[0013]在一些实施方案中，所述扩增反应在金属浴、水浴或气浴反应容器中进行，扩增反应时间为10
‑
90分钟。
[0014]在一些实施方案中，所述扩增反应在包括以下成分的缓冲液中进行：10
‑
100mM的Tris
‑
HCl、10
‑
100mM的KCl、10
‑
50mM的MgCl2，0.1
‑
10mM的NTPs，0.1
‑
10mM的dNTPs、5
‑
40％甘油、0
‑
25％DMSO(二甲基亚砜)以及0.1
‑
3μM扩增引物，pH为7.3
‑
8.2。
[0015]在一些实施方案中，所述扩增反应在包括以下成分的缓冲液中进行：20
‑
100mM的Tris、10
‑
100mM的KCl、10
‑
50mM MgCl2、0.1
‑
10mM NTP、0.1
‑
10mM dNTP、0
‑
10％甘油、0
‑
10％的DMSO、0.1
‑
3μM扩增引物、0
‑
100mM山梨醇、0
‑
10％甜菜碱、0
‑
10mM DTT(二硫苏糖醇)以及1
‑
20μg/μL的BSA(牛血清白蛋白)。
[0016]在一些实施方案中，所述方法包括采用荧光探针法或CRISPR/Cas13检测技术对扩增产物的量进行检测。
[0017]在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas13检测技术所需的crRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.改进的NASBA/TMA核酸恒温扩增方法，其中逆转录酶、RNA聚合酶以及RNA酶H均为至少在45℃仍具有活性的耐热酶，并且所述扩增反应在不低于45℃的温度下恒温进行。2.如权利要求1所述的NASBA/TMA核酸恒温扩增方法，其中所述逆转录酶、RNA聚合酶以及RNA酶H均为至少在51℃仍具有活性的耐热酶，并且所述扩增反应在47℃
‑
51℃的温度下恒温进行。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增反应无需预变性步骤。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述核酸包括DNA和/或RNA。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中所述逆转录酶为AMV逆转录酶或MMLV逆转录酶。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶为耐热型T7、T3、M13、或SP6 RNA聚合酶。7.如权利要求1
‑
6任一项所述的方法，其中所述扩增反应在金属浴、水浴或气浴反应容器中进行，扩增反应时间为10
‑
90分钟。8.如权利要求1
‑
7任一项所述的方法，其中所述扩增反应在包括以下成分的缓冲液中进行：10
‑
100mM的Tris
‑
HCl、10
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100mM KCl、10
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50mM MgCl2、0.1
‑
10mM NTPs、0.1
‑
10mM dNTPs、5
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40％甘油、0
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25％的DMSO以及0.1
‑
3μM扩增引物，pH为7.3
‑
8.2。9.如权利要求1
‑
8任一项所述的方法，其中所述扩增反应在包括以下成分的缓冲液中进行：20
‑
100mM Tris、10
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100mM的KCl、10
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50mM的MgCl2、0.1
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10mM的NTPs、0.1
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10mM的dNTPs、0
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10％甘油、0
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10％的DMSO、0.1
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3μM扩增引物、0
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100mM山梨醇、0
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10％甜菜碱、0
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10mM的DTT以及1
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20μg/μL的BSA。10.如权利要求1
‑
9任一项所述的方法，包括采用荧光探针法或CRISPR/Cas13检测技术对扩增产物的量进行检测。11.如权利要求1
‑
10任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas13检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩序，段昆，高晓庆，王珺，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：