基于比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种基于Atto

【技术实现步骤摘要】
基于比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种基于Atto
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425和AuNCs/UiO
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法。

技术介绍

[0002]统计数据显示，结直肠癌在全球的发病率以及死亡率均位列各种癌症的第三位，并呈逐年上升趋势。研究表明，通过早期筛查、诊断和治疗可以降低癌症的死亡率。早期结直肠癌患者治愈率高，5年生存率可达90％，但由于结直肠癌起病隐匿，早期不易发现，超过一半的患者在确诊时即已发生转移，因此，结直肠癌患者的早期诊断为后续治疗争取宝贵时间、降低死亡率至关重要。当前广泛使用的结直肠癌诊断方法有结肠气钡双重造影或钡灌肠、CT检查、B超和结直肠镜等。尽管这些传统的结直肠癌诊断方法已经获得临床应用，但是它们存在诊断灵敏度低、对人体损伤大、成本高等缺陷。因此，需要研发更先进的结直肠癌检测方法。
[0003]液体活检实质上是一种分子诊断技术，它将检测样本由相关组织延伸至血液、体液等液体，并且每次检测只需少量体液即可。因而，相对于传统的肿瘤检测技术，液体活检具有取样部位多样、病变发现及时、安全无并发症、能够预测病情发展、指导精准治疗以及预后等优势。研究显示，piRNA在肿瘤患者体液中异常表达，且其3
’
端存在 2
’‑
O
‑
甲基化修饰，使其能够在体液中稳定存在，在肿瘤液体活检领域展现出广阔的发展前景。piR
>‑
823是最早被确认与恶性肿瘤相关的 piRNAs之一，因其调控DNA甲基化的功能而备受学者关注，最近的一项研究表明，其血清表达水平在CRC诊断中具有良好的应用前景，将piR
‑
823检测应用于结直肠癌的早期筛查具有重要的意义。
[0004]滚环扩增技术是一种核酸信号放大技术，单链核酸分子与环状 DNA模板结合，在DNA聚合酶的作用下引物沿着模板延伸，产生大量重复片段的待测分子，从而实现核酸信号的放大，相比于传统的核酸扩增技术，滚坏扩增技术灵敏度高，特异性好，所需仪器设备简单。传统的荧光检测法存在易受背景荧光干扰以及系统复杂成分淬灭作用的不足，而比率型荧光检测方法通过不同荧光波长处信号强度变化的比值表达检测信息，具有自校准功能，提供了可视、精确、定量和实时分析的潜力，已广泛用于生物标记物的检测以及生物成像。因此，有必要构建一种基于滚环扩增的核酸信号放大技术，同时结合比率型荧光探针的检测方法以实现对结直肠癌特异性piR
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823的灵敏特异性检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对传统结直肠癌特异性piR
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823检测中存在的问题提出一种新型的基于Atto
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425和Au NCs/UiO
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piR
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823体外检测方法。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：
[0007]利用T4 DNA连接酶连接环状模板，基于phi 29 DNA聚合酶实现滚环扩增，以Atto
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425作为报告分子结合扩增产物产生荧光信号。 Au NCs/UiO
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NH2复合材料中Au NCs作
为参比荧光，UiO
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NH2 作为猝灭剂吸附并猝灭未结合的荧光报告分子，采用比率荧光法定量测定piRNA的浓度。
[0008]包括以下步骤：
[0009](1)合成UiO
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NH2：
[0010]以ZrCl4、2
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氨基对苯二甲酸和乙酸为原料，室温溶解在N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)中，利用聚四氟乙烯反应器，采用水热法制备UiO
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NH2，冷却至室温后，将所得产物用无水乙醇离心洗涤数次，在环境温度下真空干燥得到UiO
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NH2。
[0011](2)合成Au NCs：
[0012]以HAuCl4·
4H2O和还原型谷胱甘肽为原料，采用水热法制备AuNCs，产物自然降至室温后经透析获得Au NCs。
[0013](3)制备Au NCs/UiO
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NH2：
[0014]将UiO
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‑
NH2超声分散于5mL超纯水中，加入Au NCs室温搅拌 24h获得Au NCs/UiO
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NH2。
[0015](4)滚环扩增
[0016]首先，将环状模板(5p
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template)和待测样本加至无酶水中，升温至95℃并保温5min，自然冷却至室温。然后，向上述溶液中加入 T4 DNA连接酶和连接酶Buffer，于30℃孵育1h，升温至65℃保温 5min灭活T4 DNA连接酶。继而，加入phi29 DNA聚合酶、dNTP Mix 以及聚合酶Buffer，30℃孵育4h，升温至65℃保温10min灭活phi29 DNA聚合酶。随后加入荧光报告分子(Reporter)于30℃孵育1.5h，最后加入Au NCs/UiO
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NH2孵育30min吸附未结合的Reporter，利用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度，计算待测piRNA的浓度。
[0017](5)方法学评价
[0018]对该检测方法的灵敏度、特异性以及结果准确度进行方法学评价。
[0019]作为优选，所述步骤(1)中ZrCl4物质的量为0.32mmol，质量为 75mg，2
‑
氨基对苯二甲酸物质的量为0.32mmol，质量为58mg。将上述混合物溶解在15mL的DMF中，同2mL乙酸一起加入聚四氟乙烯反应器中，置于120℃预热烘箱中保温24h，冷却至室温后，将所得产物用无水乙醇离心洗涤3次，室温下真空干燥得到UiO
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‑
NH2。
[0020]作为优选，所述步骤(2)中HAuCl4·
4H2O浓度为5mM,体积为10 mL，将上述溶液加入三颈烧瓶中，于25℃搅拌5min，氮气气氛下将10mL含0.075mmol还原型谷胱甘肽的水溶液加至三颈烧瓶中继续搅拌5min。持续搅拌下，升温至100℃并保温12h，冷却至室温后经透析获得Au NCs。
[0021]作为优选，所述步骤(3)中UiO
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NH2的质量为20mg，将其超声分散于5mL超纯水中，加入5mL的Au NCs室温搅拌24h获得 Au NCs/UiO
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Atto
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425和Au NCs/UiO
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法，其特征在于，利用T4 DNA连接酶连接环状模板，基于phi 29 DNA聚合酶实现piRNA滚环扩增，以Atto
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425作为报告分子结合滚环扩增产物产生荧光信号；Au NCs作为参比荧光，UiO
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NH2作为猝灭剂吸附并猝灭未结合的荧光报告分子，采用比率荧光法定量测定piRNA的浓度。2.根据权利要求1所述基于Atto
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425和Au NCs/UiO
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法，其特征在于，Atto
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425荧光发射峰为485 nm，Au NCs的发射峰为625 nm。3.根据权利要求1所述基于Atto
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425和Au NCs/UiO
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法，其特征在于，所述滚环扩增步骤的目的分子为piR
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823，序列为：5
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AGCGUUGGUGGUAUAGUGGUGAGCAUAGCUGC
‑3’
，环状模板的5
’
端修饰有磷酸根，序列为：5
’‑
P
‑
CACTATACCACCAACGCTTCTAGGTTGAGTAAGTCGATGCAGCTATGCTCAC
ꢀ‑3’
,荧光报告分子的5
’
端修饰有Atto
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425荧光分子，序列为：5
’‑
Atto
‑
425
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TAGGTTGAGTAAGTC
‑3’
。4.根据权利要求3所述基于Atto
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425和Au NCs/UiO
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66
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NH2的比率荧光和滚环扩增的piRNA体外检测方法，其特征在于，滚环扩增的具体步骤为：将3μL待测样本加至含2μL、10nM的环状模板的1.965mL无酶水中，于95℃保温5min后自然冷却；加入1 μL T4 DNA连接酶和2μL的连接酶Buffer，于30℃孵育1 h，然后升温至65℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜鲁涛，蒋妍彦，王传新，童尧，孙志伟，李娟，李培龙，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：