一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及微生物快速检测
，具体地，涉及一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]鸭疫里氏杆菌病的临床表现与其他细菌感染如多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和肠道沙门氏菌相似。因此，很难通过病理特征来诊断鸭疫里氏杆菌感染。诊断鸭疫里氏杆菌感染的实验室方法主要基于平板培养、聚合酶链式反应、环介导等温扩增、酶联免疫吸附试验、凝胶扩散沉淀试验和玻片凝集试验。上述诊断方法的优点是具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但上述诊断方法通常需要较长时间，方法比较繁琐或需要昂贵的仪器设备和高技能的人员。
[0003]目前鸭疫里氏杆菌感染的确诊仍然以实验室方法为基础，这限制了对鸭疫里氏杆菌杆菌病的早期诊断，早期发现，早期治疗。实验室方法的复杂性，繁琐性也不利于鸭疫里氏杆菌的大规模筛查。开发一种快速、现场、敏感、特异的定量检测方法，对于我国养鸭业具有重要的战略意义。
[0004]CRISPR
‑
Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR
‑
associated proteins,Cas)构成CRISPR
‑
Cas系统。CRISPR
‑
Cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，CRISPR
‑
Cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。
[0005]重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。RPA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，RPA省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。RPA技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。
[0006]但是由于RPA扩增产物需要琼脂糖凝胶电泳来分析结果，使得该技术无法实施现场的即时检测。近年来，RPA技术也引入荧光探针法，使得检测结果可视化。但是，荧光探针的设计复杂，且探针的特异性不稳定，假阳性的结果时有发生。这在很大程度上限制了RPA技术在快速诊断方面的应用。
[0007]将CRISPR
‑
Cas12a检测系统与RPA技术结合，通过RPA技术常温扩增目的片段，然后
进行CRISPR
‑
Cas12a检测反应，最后通过Cas12/13专用核酸检测试纸条进行结果的可视化。此结合的意义在于不需要在RPA扩增阶段引入探针，避免假阳性的产生，同时利用CRISPR
‑
Cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性。该检测方法只需要改变CRISPR
‑
Cas12a检测反应中的特异性crRNA序列即可实现多种病原微生物的检测，大大提高了检测的适用性及使用范围。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒。
[0009]本专利技术的第一目的是提供一种用于检测鸭疫里氏杆菌的组合物。
[0010]本专利技术的第二目的是提供上述组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术的第三目的是提供一种检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒。
[0012]本专利技术的第四目的是提供一种非诊断目的可视化检测鸭疫里氏杆菌的方法。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0014]一种组合物，所述组合物包括特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针；所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0015]优选地，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物RPA
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示.
[0016]优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0017]更优选地，所述探针的5
’
端标记荧光基团。
[0018]更优选地，所述探针的3
’
端标记淬灭基团。
[0019]进一步优选地，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素(FITC)或6
‑
羧基荧光素(6
‑
FAM)。
[0020]进一步优选地，所述淬灭基团为生物素(Biotin)。
[0021]具体地，所述序列如下所示：
[0022]特异性crRNA1(SEQ ID NO：1)：
[0023]5’‑
AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUAUCAACAGGUUUAGG
‑3’
，
[0024]上游引物RPA
‑
F(SEQ ID NO：3)：
[0025]5’‑
ATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGA
‑3’
，
[0026]下游引物RPA
‑
R(SEQ ID NO：4)：
[0027]5’‑
TCCATCCTTATCCTTATCTCTGTTACCA
‑3’
，
[0028]探针(SEQ ID NO：5)：
[0029]5’‑
(6
‑
FAM)
‑
TTATT
‑
(Biotin)
‑3’
。
[0030]本专利技术还请求保护上述组合物在制备鸭疫里氏杆菌检测试剂盒中的应用。
[0031]一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
[0032]优选地，所述试剂盒还包含Cas12/13专用核酸检测试纸条。
[0033]更优选地，所述Cas12/13专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线。
[0034]进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针；所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述特异性RPA引物对的上游引物RPA
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物RPA
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，探针5
’
端标记荧光基团。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针的3
’
端标记淬灭基团。5.根据权利要求3所述的组合物，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊文广，谢龙飞，李燕红，郝杰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：