一种核酸POCT检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体涉及一种核酸POCT检测试剂盒。本发明专利技术提供的检测体系为基于Toehold调控的Cas12a/crRNA的反式切割活性和链置换/杂交链式反应构建，基于该检测体系的检测方法，灵敏度高、特异性好、操作简便，不需要复杂的仪器。不需要复杂的仪器。不需要复杂的仪器。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸POCT检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种核酸POCT检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]核酸作为生命的最基本物质之一，广泛的存在于所有的动物、植物和微生物细胞内。沃森
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克里克发现DNA双螺旋结构和碱基配对规则，标志着生命科学研究正式进入分子生物学时代。随着核酸的合成和测序技术的不断发展，核酸检测在感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学等中得到了广泛的应用。因此，越来越多的核酸检测方法被研发和应用，这些方法主要包括核酸电泳、核酸杂交、基因芯片、基因测序、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、以及在其基础上发展的多重 PCR 技术、数字实时聚合酶链反应技术等。这些方法因为操作繁琐，成本较高，耗时长，需要复杂的仪器设备，较高的实验环境和专业的操作人员等因素而不利于大规模应用，不能满足临床对疾病早期、即时诊断的需求，导致患者的诊断时间延长，错过最佳治疗时机，甚至危及生命。
[0003]即时检测（POCT）即在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。因具有携带方便、检测快速、操作便捷、对于检测条件和人员适用性高、可在患者旁开展以及在户外或资源贫乏地区进行环境致病菌检测等特点被广泛的应有于心血管疾病、糖尿病、肿瘤和感染性疾病等多个领域。
[0004]CRISPR
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Cas系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat and CRISPR
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Associated Protein）是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，可以保护它们免受噬菌体、病毒和质粒的入侵。Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系统中被广泛应用的标志性核酸酶，因可以特异性切割靶标双链DNA，被广泛应用于靶向识别和基因编辑。随着对CRISPR
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Cas系统的研究深入，发现Cas12和Cas13具有相类似的特性，即在与靶标DNA结合后，除了可以特异性的切割靶基因外，还可以非特异性切割体系中的附属ssDNA/ssRNA，显示出高特异性和快速核酸检测的巨大应用前景。然而，当前报道的应用CRISRP
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Cas系统的信号输出部分多通过荧光信号和电信号，这就需要一些复杂的仪器来收集信号，不能满足POCT检测的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种核酸POCT检测试剂盒及检测方法。
[0006]本专利技术所采取的方案如下：一种核酸POCT检测试剂盒，包括：Cas12a/crRNA酶切体系，包括杂交双链DNA Toehold、Cas12a、crRNA；链置换/HCR扩增体系，包括亲和素磁珠、G4
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H1和G4
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H2；TMB显色体系，包括含钾离子的缓冲液、氯化血红素、TMB；所述杂交双链DNA Toehold为biotin
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H0、G4
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CT和G4
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S共同孵育形成；biotin
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H0序列如SEQ ID NO.1所示；
G4
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CT序列如SEQ ID NO.2所示；G4
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S序列如SEQ ID NO.3所示；G4
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H1序列如SEQ ID NO.4所示；G4
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H2序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]优选的，所述biotin
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H0、G4
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CT和G4
‑
S的摩尔比为10:1:10；biotin
‑
H0、G4
‑
CT和G4
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S在90
‑
100℃金属浴上孵育3
‑
8分钟，然后降温至35
‑
40℃孵育以形成杂交双链DNA Toehold。
[0008]一种核酸POCT检测方法，所述方法为非治疗或诊断目的的，其采用如上所述的核酸POCT检测试剂盒；所述方法包括以下步骤：（1）将Cas12a和crRNA预孵育，然后加入DNA Toehold、待测溶液，进行CRISPR/Cas12a酶切反应；（2）将CRISPR/Cas12a酶切后溶液加入亲和素磁珠中，振荡进行偶联反应，然后通过磁性分离收集偶联后的亲和素磁珠；（3）采用G4
‑
H1和G4
‑
H2对偶联后的亲和素磁珠进行HCR扩增，得到HCR扩增后的亲和素磁珠；（4）将含钾离子的缓冲液、氯化血红素和HCR扩增后的亲和素磁珠进行避光孵育，然后磁性分离收集磁珠，加入TMB避光孵育，通过浓硫酸终止反应。
[0009]优选的，步骤（1）中，Cas12a、crRNA、DNA Toehold的摩尔比为2:5:2。
[0010]优选的，步骤（2）中，亲和素磁珠先用B&W缓冲液洗涤，然后进行偶联；步骤（3）中，CRISPR/Cas12a酶切后溶液与亲和素磁珠室温下剧烈振荡25
‑
40min完成偶联反应。
[0011]优选的，步骤（3）中，G4
‑
H1和G4
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H2在90
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100℃金属浴上孵育5
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15min，然后冷却至室温后与偶联了DNA Toehold后的亲和素磁珠、HCR 杂交缓冲液在35
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40℃下振荡孵育0.8
‑
1.2 h。
[0012]优选的，步骤（4）中，将Tris
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Hcl
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KCl、氯化血红素溶液、HCR扩增后的亲和素磁珠在35
‑
40℃ 避光孵育25
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40 min；磁性分离收集的磁珠与TMB溶液室温避光孵育10
‑
20 min。
[0013]优选的，通过肉眼观察TMB孵育反应后的溶液定性判断是否含有目标核酸，当体系中不含有目标核酸时，TMB显色，当体系中含有目标核酸时，TMB不显色。
[0014]优选的，通过酶标仪在360 nm
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520 nm处扫描溶液的吸光度可对目标病菌定量检测。
[0015]本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的检测体系为基于Toehold调控的Cas12a/crRNA的反式切割活性和链置换/杂交链式反应构建，基于该检测体系的检测方法，灵敏度高、特异性好、操作简便，不需要复杂的仪器。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
nm处扫描溶液的吸光度可对目...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑来宝，姜亚运，楼永良，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：