【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
野生型分子库中低频变体的靶向检测对于癌症的早期检测、癌症进展的监测、癌症疗法的靶向、非侵入性产前检查、靶向特定(新)抗原的t细胞群的监测，以及对于器官移植排斥的早期预警在临床上很重要。杂交捕获和下一代测序(ngs)的组合是低频变体靶向多重检测最常应用的方法，但具有几个次优特征。一般来说，杂交捕获使感兴趣的靶区富集，但不富集变体分子。这导致绝大多数测序读段来源于野生型而不是变体分子。这是浪费，增加了成本，并且使得在储存、文库制备和测序错误的背景下难以检测罕见变体。这导致ngs对于变体的常规检测特异性不足，低于～0.1％。改良文库制备方法(诸如双链体测序)可以提高特异性，从单分子中得到准确的测序数据。不幸的是，双链测序等方法也会降低灵敏度(例如，通过修改文库制备方法以避免末端修复以及通过故意施加分子瓶颈)。这里描述的方法允许使用例如基于焦磷酸解(ppl)的改良杂交捕获方法富集位于感兴趣的靶区内的变体分子。这既减少所需测序读段的数目，又为低于当前ngs检测极限的低频变体分子的多重检测打开了大门。
技术介绍
技术实现思路
1、在一些实施方案中，本文提供了基于焦磷酸解反应的杂交方法。这些方法利用焦磷酸解的双链特异性；焦磷酸解是用包含核苷酸错配的阻断基团的单链寡核苷酸底物或双链底物不能有效进行的反应。
2、例如，在一些实施方案中，本文提供的方法包括使样品(例如，含有两种或更多种不同的核酸分子)与探针和焦磷酸解反应试剂接触，以及基于探针与第一和第二核酸分子的不同互补性，使第一核酸分子相对于第二核
3、例如，在一些实施方案中，方法包括通过使第一核酸分子与探针接触而使包含核酸分子混合物的样品中的第一核酸分子富集或消耗，所述探针与所述样品中第一核酸分子上的靶区的互补性相对于的其它核酸分子不同；进行焦磷酸解反应；以及使第一核酸分子富集或消耗。在一些实施方案中，探针与样品中第一核酸分子的靶区的互补性大于所述探针与第二核酸的相应靶区的互补性。在一些实施方案中，探针与样品中第一核酸分子的靶区的互补性小于所述探针与第二核酸的相应靶区的互补性。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸因序列变异(例如，点突变、缺失、插入、多核苷酸变化、融合等)而不同。在一些实施方案中，探针包括与具有较大互补性的序列的靶区完美互补并且与在具有较小互补性的序列的相应靶区中发现的序列变异具有一个或多个错配的序列。在一些实施方案中，探针含有与第一和第二核酸分子的靶区的一个或多个错配，但含有与具有较小互补性的核酸的靶区的更多错配。具体而言，探针设计成使得当探针与第一核酸杂交时相对于与第二核酸杂交时焦磷酸解的程度不同，从而容许基于通过焦磷酸解产生的不同反应产物相对于第二核酸选择性富集或消耗第一核酸。
4、例如，在一些实施方案中，本文提供了用于增加或降低样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其包括：a)将包含第一核酸序列和第二核酸序列的样品暴露于探针，所述探针与所述第一核酸序列和第二核酸序列的互补性不同；b)进行焦磷酸解反应；以及c)使所述第一核酸序列相对于所述第二核酸序列富集或消耗。
5、在本专利技术的一些实施方案中，提供了一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其中所述样品至少包含第一序列和第二序列，所述方法包括以下步骤：
6、a.将包含一种或多种核酸分析物的所述样品引入到第一反应混合物中，所述第一反应混合物包含：
7、i.与第一和第二核酸序列具有差异互补性的单链探针寡核苷酸a0(例如，其中所述探针的3'末端与第一或第二序列中的一个序列完美互补，但与另一个序列不完美互补)；
8、b.将步骤(a)产生的反应混合物引入到第二反应混合物中，所述第二反应混合物包含：
9、ii.焦磷酸解酶；和
10、iii.焦磷酸根离子源
11、其中a0(例如，完美地)与所述核酸序列中的一个序列退火以产生至少部分双链的中间产物，其中a0(例如，a0的3’-末端)与所述序列形成双链复合物并且a0在3’-5’方向上从其3’-末端焦磷酸解，而与另一个序列不太完美地(例如，不完美地)退火的任何a0由于所述不太完美的(例如，不完美的)退火而在3’-5’方向上在较小程度上焦磷酸解；
12、c.通过以下方式分离更完美地(例如，完美地)退火的任何a0序列复合物：
13、iv.使所述复合物的链由于所述焦磷酸解反应而分离(例如，解链分开)；或者
14、v.将所述反应混合物加热至足以所述复合物的链分离(例如，解链分开)的温度，但所述温度低于不太完美地(例如，不完美地)退火的任何a0链分离(例如，解链分开)所需的温度；并且
15、d.将a0及由此保持与之退火的任何核酸序列与不与a0退火的任何核酸序列分离。
16、探针可具有一种或多种组分，这些组分在焦磷酸解反应之前或期间去除。例如，探针可在其3'末端具有非互补瓣或其它阻断基团，其防止焦磷酸解或聚合酶反应的引发，直至阻断基团被去除。阻断基团可以通过任何合适的机制(例如，酶促裂解、化学反应、温度变化等)去除。当与不同的核酸分子杂交时提供差异性焦磷酸解产物的探针的序列可以位于初始探针中任何合适的位置。例如，错配序列可以位于探针3'末端的3'端碱基处。错配序列可以位于3'末端探针内部。错配序列可以位于探针中心。错配序列可以位于探针的5'半以内。
17、探针的5'末端可以包含充当标识符(例如，样品标识符)的区域(例如，5'尾)。此类序列例如可用于选择性地从特定样品或混合样品中的特定区域中逐个拉下捕获的分子。此类标识符可以在多重区域中特别有用，其中多个不同的靶标在相同的样品或相同的反应容器中进行反应。
18、可应用本专利技术的方法的分析物/序列是包括所寻找的靶多核苷酸序列的那些核酸，诸如天然存在的或合成的dna或rna分子。在一些实施方案中，分析物/序列通常将存在于含有它和其它生物材料的水溶液中，并且在一些实施方案中，分析物/序列将与并非出于检查目的而感兴趣的其它背景核酸分子一起存在。在一些实施方案中，分析物/序列将以相对于这些其它核酸组分低的量存在。优选地，例如在分析物源自含有细胞材料的生物样本的情况下，在进行所述方法的步骤(i)之前，这些其它核酸和外来生物材料中的一些或全部已经使用样品制备技术诸如过滤、离心、色谱法或电泳去除。
19、本专利技术的组合物和方法可用于任何类型的样品，包括但不限于环境(例如水、土壤、空气等)样品和生物样品。生物样品可以来自任何来源，包括植物、动物、传染病病原体等。合适地，在一些实施方案中，分析物/序列源自取自哺乳动物受试者(尤其是人类患者)的生物样品，诸如血液、血浆、痰、尿液、皮肤、活检或手术切除物。在一些实施方案中，生物样品将经受裂解，以便通过破坏存在的任何细胞来释放分析物/序列。在其它实施方案中，分析物/序列可能已经以游离形式存在于样品本身内；例如，在血液或血浆本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种方法，其包括：使样品与探针和焦磷酸解反应试剂接触；以及基于所述探针与所述第一核酸分子和第二核酸分子的差异互补性，使第一核酸分子相对于第二核酸分子富集或消耗。
2.一种方法，其包括：通过以下使包含核酸分子混合物的所述样品中的第一核酸分子富集或消耗：使样品与探针接触，所述探针与所述样品中第一核酸分子的靶区的互补性相对于第二核酸分子不同；进行焦磷酸解反应；以及使所述第一核酸分子富集或消耗。
3.一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其包括：a)将包含所述第一核酸序列和第二核酸序列的样品暴露于探针，所述探针与所述第一核酸序列和第二核酸序列的互补性不同；b)进行焦磷酸解反应；以及c)使所述第一核酸序列相对于所述第二核酸序列富集或消耗。
4.一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其中所述样品至少包含第一序列和第二序列，所述方法包括以下步骤：
5.一种如权利要求4所述的方法，其中所述第一反应混合物和第二反应混合物组合，使得步骤(a)的所述第一反应混合物还包含焦磷酸解酶和焦磷酸根离子源。
7.如权利要求6所述的方法，其中A0还包含与所述序列中的任一个均不互补的5'尾区。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述捕获到所述固体支持物上是通过A0的所述5'尾区与包含捕获部分的另一寡核苷酸C0的杂交进行的，所述另一寡核苷酸C0在与A0杂交之前或之后通过捕获部分结合至所述固体支持物。
9.如权利要求6或7所述的方法，其中A0还包含捕获部分，所述A0通过所述捕获部分结合至所述固体支持物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述捕获部分是生物素并且所述固体支持物包含链霉亲和素。
11.如权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是珠粒。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述珠粒是磁珠或顺磁珠。
13.如任一前述权利要求所述的方法，其中在所述步骤中的一个或多个之间进行一个或多个洗涤步骤。
14.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品是衔接子标记的核酸分析物文库。
15.如权利要求4至14中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，鉴定保持与A0退火的所述核酸或不与A0退火的所述核酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过扩增来鉴定。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过微阵列分析来鉴定。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过测序来鉴定。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述序列通过下一代测序(NGS)来鉴定。
20.如任一前述权利要求所述的方法，其中采用多种不同的探针寡核苷酸，每种探针寡核苷酸具有设计为与不同的靶序列退火的不同序列，并且其中多个靶序列的浓度相对于非靶序列同时增加。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述不同的探针寡核苷酸具有与人类基因组的序列退火的序列，所述人类基因组的序列包括与人类健康的诊断、治疗或监测相关的遗传变体。
22.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与A0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体的存在或不存在，并且由此推断疾病或疾患的存在或不存在。
23.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与A0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且由此推断疾病或疾患的适当治疗。
24.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与A0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且由此推断患者对特定疾病或疾患治疗的应答。
25.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与A0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且基于所述遗传变体存在与否做出一种或多种患者治疗决策。
26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述样品是人血或组织样品。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症选自由肺癌、结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、尿道癌、脑癌和皮肤癌组成的组。<...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种方法，其包括：使样品与探针和焦磷酸解反应试剂接触；以及基于所述探针与所述第一核酸分子和第二核酸分子的差异互补性，使第一核酸分子相对于第二核酸分子富集或消耗。
2.一种方法，其包括：通过以下使包含核酸分子混合物的所述样品中的第一核酸分子富集或消耗：使样品与探针接触，所述探针与所述样品中第一核酸分子的靶区的互补性相对于第二核酸分子不同；进行焦磷酸解反应；以及使所述第一核酸分子富集或消耗。
3.一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其包括：a)将包含所述第一核酸序列和第二核酸序列的样品暴露于探针，所述探针与所述第一核酸序列和第二核酸序列的互补性不同；b)进行焦磷酸解反应；以及c)使所述第一核酸序列相对于所述第二核酸序列富集或消耗。
4.一种用于增加样品中第一核酸序列与第二核酸序列的比率的方法，其中所述样品至少包含第一序列和第二序列，所述方法包括以下步骤：
5.一种如权利要求4所述的方法，其中所述第一反应混合物和第二反应混合物组合，使得步骤(a)的所述第一反应混合物还包含焦磷酸解酶和焦磷酸根离子源。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中步骤(d)中的所述分离是通过在步骤(a)之前或之后将a0捕获到固体支持物上进行的。
7.如权利要求6所述的方法，其中a0还包含与所述序列中的任一个均不互补的5'尾区。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述捕获到所述固体支持物上是通过a0的所述5'尾区与包含捕获部分的另一寡核苷酸c0的杂交进行的，所述另一寡核苷酸c0在与a0杂交之前或之后通过捕获部分结合至所述固体支持物。
9.如权利要求6或7所述的方法，其中a0还包含捕获部分，所述a0通过所述捕获部分结合至所述固体支持物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述捕获部分是生物素并且所述固体支持物包含链霉亲和素。
11.如权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是珠粒。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述珠粒是磁珠或顺磁珠。
13.如任一前述权利要求所述的方法，其中在所述步骤中的一个或多个之间进行一个或多个洗涤步骤。
14.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品是衔接子标记的核酸分析物文库。
15.如权利要求4至14中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，鉴定保持与a0退火的所述核酸或不与a0退火的所述核酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过扩增来鉴定。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过微阵列分析来鉴定。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述序列通过测序来鉴定。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述序列通过下一代测序(ngs)来鉴定。
20.如任一前述权利要求所述的方法，其中采用多种不同的探针寡核苷酸，每种探针寡核苷酸具有设计为与不同的靶序列退火的不同序列，并且其中多个靶序列的浓度相对于非靶序列同时增加。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述不同的探针寡核苷酸具有与人类基因组的序列退火的序列，所述人类基因组的序列包括与人类健康的诊断、治疗或监测相关的遗传变体。
22.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与a0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体的存在或不存在，并且由此推断疾病或疾患的存在或不存在。
23.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与a0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且由此推断疾病或疾患的适当治疗。
24.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与a0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且由此推断患者对特定疾病或疾患治疗的应答。
25.如权利要求21所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过鉴定已经与a0退火并且随后已经被释放或保留的核酸序列来推断所述样品分析物中所述遗传变体存在或不存在，并且基于所述遗传变体存在与否做出一种或多种患者治疗决策。
26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述样品是人血或组织样品。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症选自由肺癌、结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、尿道癌、脑癌和皮肤癌组成的组。
29.一种试剂盒，其包含：
30.如权利要求29所述的试剂盒，其还包含靶核酸分离组分，所述靶核酸分离组分在焦磷酸解反应后将与所述探针具有较高互补性的靶核酸分子和与所述探针具有较低互补性的核酸分子分开。
31.如权利要求29所述的试剂盒，其还包含一种或多种固体支持物。
32.如权利要求29至31中任一项所述的试剂盒，其还包含一种或多种缓冲剂。
33.如权利要求29至32中任一项所述的试剂盒，其中a0还包含与已知第一序列或已知第二序列不互补的5'尾区。
34.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中a0还包含捕获部分。
35.如权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一个或多个包含捕获部分的捕获寡核苷酸c0，并且其中a0的5'尾区与c0的区域互补。
36.如权利要求34或权利要求35所述的试剂盒，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·奥斯本，M·斯托拉雷克雅努什凯维奇，B·巴尔姆福斯，
申请(专利权)人：生物保真有限公司，
类型：发明
国别省市：
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