【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统及其方法。
技术介绍
1、人基因组有两个高度同源的运动神经元存活基因（survival motor neuron，smn），包括smn1和smn2，两者相邻，位于5q13.2，smn1在端粒侧，smn2在着丝粒侧。smn1和smn2同源性大于99.9%，仅存在5个碱基差异，其中位于第7外显子第6位c.840的c/t（smn1为c.840 c，smn2为c.840 t）导致90%的smn2 mrna第7外显子被选择性剪接，仅有10%的smn2表达全长有功能的smn蛋白。sma是由于smn1发生纯合或复合杂合突变（杂合缺失伴点突变）导致。
2、smn1外显子7缺失大部分会合并外显子8共同缺失，少部分仅为外显子7缺失。而smn1微小变异在不同种族患者中表现出不同的变异谱系，目前国内外已报道的微小变异约90种（http://www.hgmd.cf.ac.uk/），中国患者已报道近30种，其中检测频次≥2，并经美国医学遗传与基因组学学会（acmg）致病性评估确认的微小变异有7种，见表1。
3、表1 中国人群常见smn1微小变异位点
4、。
5、sma作为单基因遗传病，通过对smn1的基因检测而实施三级预防策略可有效降低sma的发生率，是防治sma的最佳选择。但由于smn1基因的特点，针对sma携带者筛查、新生儿筛查或是sma产前诊断，现有的检测技术主要是针对smn1基因第7外显子的拷贝数检测，不能分
6、smn基因的微小变异只有位于smn1上才有临床意义。目前，国内外均无针对smn1微小变异检测的有效技术方法，造成这一困局的原因是：smn1和smn2基因高度同源，仅有5个碱基的差异；两基因长度均为28kb，常见微小变异位点与差异位点c840c＞t之间的距离远大于常规检测方法如长片段pcr的扩增能力；smn1基因的外显子和内含子均可发生微小变异，同时smn1的常见错义突变和移码突变，产生提前终止密码子，导致无义介导的mrna降解（nonsense-mediated mrna decay，nmd），因此，基于mrna逆转录的基因突变检测也受限。可以说，常规的检测方法无法避免smn2基因的干扰，即无法确定检测到的微小变异是位于smn1基因上，还是位于smn2基因上。
7、目前尝试检测smn1微小变异常采用3种策略：（1）smn1特异性长片段pcr结合巢式pcr：如专利技术cn107058575a 提供的，根据smn1和smn2差异碱基，设计等位基因特异性引物用以特异性扩增整个smn1基因组dna序列，再以长片段扩增产物作为模板通过巢式pcr扩增每个外显子区域，通过sanger测序检测smn1序列是否存在基因变异；（2）rt-克隆测序方法：如专利技术cn107881214a提供的，由于smn1微小变异会导致无义介导的mrna降解机制，使smn1mrna的丰度低，通过用shrna处理患者的细胞抑制该降解机制，然后提取总rna，通过逆转录qpcr方法对目标突变进行检测，或是根据smn1和smn2差异碱基挑选smn1单克隆，通过sanger测序方法检测来源于smn1的cdna基因变异。（3）长读长三代测序：如cn114317728a提供的一种基于长片段pcr扩增，结合读长测长的三代纳米孔测序平台，检测sma相关2种基因中的多种突变。前两种方法，样本处理的工作量巨大、时间长，程序复杂，耗费大量人力，成本高昂，效率低下；第一、三种方法需要通过arms-pcr长片段扩增smn1，以区别于smn2，而smn1基因长度为28kb，现有的长片段结合c.840c差异位点的arms-pcr，对扩增超过5kb的片段，扩增技术和操作难度非常大，扩增效率低。而且第三种方法的成本极高，检测时间长。故这三种方法均不适合基于规模人群的携带者筛查和新生儿筛查，多用于科研，无法应用到临床。
技术实现思路
1、为了克服上述问题， 本专利技术提供一种确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统，所述smn基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，所述系统包括以下组成：
2、第一组成，所述第一组成用于检测smn基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变是否存在的试剂盒；
3、第二组成，人基因组dna提取试剂盒，所述dna提取试剂盒提取的人基因组dna片段长度不小于50kb；
4、第三组成，所述第三组成用于确定一个或多个待检测突变是位于smn1基因或smn2基因上的试剂盒，所述第三组成是多重数字pcr试剂盒，所述多重数字pcr试剂盒包括：检测smn1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 c的数字pcr引物和探针，smn1上第7外显子上第6位的差异位点c.840 c作为第一锚定位点，和第二组成提取的人基因组dna，其作为数字pcr检测中使用的模板；
5、检测smn2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 t的数字pcr引物和探针，smn2上第7外显子上第6位的差异位点c.840 t作为第二锚定位点；
6、检测所述一个或多个待检测突变的数字pcr引物和探针；
7、检测第一锚定位点、第二锚定位点和一个或多个待检测突变的探针标记不同的荧光，在检测结果中，若第一锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第二锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于smn1基因上；若第二锚定位点与一个待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值比第一锚定位点与所述待检测突变双阳性液滴与总阳性液滴比值高，则该待检测突变位于smn2基因上。
8、在一种实施方式中，第一组成是用于检测smn基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变荧光定量pcr试剂盒。
9、在一种实施方式中，所述dna提取试剂盒提取的人基因组dna片段长度在50-250kb之间。
10、在一种实施方式中，所述第一组成是用于检测smn基因上c.22dupa、c.400g>a、c.463_464delaa、c.683t>a、c.689c>t、c.835-5t>g、c.863g>t中一个或多个突变是否存在的试剂盒。
11、在一种实施方式中，所述试剂盒是熔解曲线法qpcr检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针：
12、。
13、在一种实施方式中，所述第三组成包括以下引物和探针，
14、。
15、在一种实施方式中，本专利技术提供一种确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的方法，所述smn基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，所述方法包括以下步骤：<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.确定SMN基因突变位于SMN1基因或SMN2基因上的系统，所述SMN基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，其特征在于，所述系统包括以下组成：
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一组成是用于检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变荧光定量PCR试剂盒。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述DNA提取试剂盒提取的人基因组DNA片段长度在50-250 kb之间。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一组成是用于检测SMN基因上c.22dupA、c.400G>A、c.463_464delAA、c.683T>A、c.689C>T、c.835-5T>G、c.863G>T中一个或多个突变是否存在的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述试剂盒是熔解曲线法qPCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针：
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述第三组成包括以下引物和探针，
7.确定SMN基因突变位于SMN1基因或S
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1中通过熔解曲线法qPCR方法检测SMN基因第一外显子和第七外显子之间是否存在一个或多个待检测突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述一个或多个待检测突变是c.22dupA、c.400G>A、c.463_464delAA、c.683T>A、c.689C>T、c.835-5T>G、c.863G>T中一个或多个突变。
...【技术特征摘要】
1.确定smn基因突变位于smn1基因或smn2基因上的系统，所述smn基因突变位于第一外显子和第七外显子之间，其特征在于，所述系统包括以下组成：
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一组成是用于检测smn基因第一外显子和第七外显子之间一个或多个待检测突变荧光定量pcr试剂盒。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述dna提取试剂盒提取的人基因组dna片段长度在50-250 kb之间。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一组成是用于检测smn基因上c.22dupa、c.400g>a、c.463_464delaa、c.683t>a、c.689c>t、c.835-5t>g、c.863g>t中一个或多个突变是否存在的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的系统...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖昊，钱俊杰，王思贤，
申请(专利权)人：北京致谱医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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