一种错配结合蛋白突变体及其在自动化工作站高通量基因纠错中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种错配结合蛋白突变体及其在自动化工作站高通量基因纠错中的应用。本发明专利技术提供了一种融合蛋白，为将错配结合蛋白突变体与biotin和EGFP融合后所得；所述错配结合蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1

【技术实现步骤摘要】
一种错配结合蛋白突变体及其在自动化工作站高通量基因纠错中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种错配结合蛋白突变体及其在自动化工作站高通量基因纠错中的应用。

技术介绍

[0002]目前，合成生物学的快速发展已得到广泛认可，并在不同水平的各种生物系统的设计和工程中得到了广泛应用，例如生物分子工程，基因线路和网络设计，代谢工程以及整个染色体或基因组的设计(Liu et al.,2019,Dueber et al.,2003,Elowitz et al.,2000)。传统的DNA合成技术使用基于DNA聚合酶的(Stemmer et al.,1995)或基于DNA连接酶的组装方法(Au et al.,1998)，将柱合成的寡核苷酸(oligonucleotides)用作基因构建的基础。近年来，利用DNA微芯片功能的新型大规模自动化基因合成方法，使得快速，经济的合成任意长度的DNA片段成为可能(Hughes et al.,2017)。DNA合成产物中的高错误频率是基因从头合成(de novo gene synthesis)中面临的瓶颈问题(Kosuri and Church，2014)。使用酶纠错方法是经济有效的去除合成错误的方法，主要包括大肠杆菌错配修复蛋白(MutS)和错配切除蛋白(例如，Resolvase)，通常，这些酶通过特异性结合并删除，DNA双链通过变性退火而随机组合的正确和错误的单链以达到纠错的目的(Ma et al.,2011)。Lubock等人通过系统比较六种不同的纠错酶，发现eMutS最适用于增加完美组装的数量(最高25.2倍)(Lubock et al.,2017)。
[0003]DNA错配修复系统(MMR)催化复制后的切除反应，该反应通过消除复制错误导致的碱基错配来增加DNA复制的保真度，广泛存在于原核和真核生物中(Iyer et al.,2006,Kolodner,1996,Kolodner and Marsischky,1999)。MutS蛋白为MMR的重要组成部分，其大小为97kDa，尽管对不同类型错配的亲和力有所不同，但已证明MutS蛋白可与所有的单碱基错配，以及一到四个碱基的缺失或插入结合(Whitehouse et al.,1997)。MMR过程首先由纯化自大肠杆菌的活性成分进行体外重构实验(Lahue et al.,1989)，并且，最典型的错配修复系统之一是大肠杆菌MutHLS酶复合物系统(Mordrich and Lahue，1996，Jricny，1998)。源自大肠杆菌(EcoMutS)的MutS，对于转换(transition)的修复效率较颠换(transvertion)高(GT≈GG≈CA≈AA＞TT≈TC≈AG＞CC)，同时，EcoMutS与错配碱基的结合能力也受错配附近碱基序列的影响，修复效率随着相邻序列中GC含量的增高而增高(Brown et al.,2001，Jones et al.,1987)。当前，MutS介导的纠错方法主要针对组装产物进行验证，通常使用来自水生栖热菌(TaqMutS)的Muts，因为与大肠杆菌MutS(EcoMutS)相比，它热稳定性更高并且对完全匹配的DNA具有较弱的结合能力，然而，与含错配的DNA的结合亲和力却远低于EcoMutS，这极大地降低了MutS介导的纠错方法的效率(Brown et al.,2001；Cho et al.,2007)。近年来，Wan等开发了通过固定eMutS蛋白以去除芯片合成的寡核苷酸中的错误，以及使用这些寡核苷酸组装DNA片段的方法。该方法通过将EcoMutS和TaqMutS固定于纤维素柱，特异性结合错配寡核苷酸片段，并经洗脱收集完全匹配的寡核苷酸片段，具
有低成本和高通量的优势，但是，由于eMutS较差的热稳定性，而限制了其广泛应用(Wan et al.,2014,Wan et al.,2017)。
[0004]对于此问题，申请人前期获得了具有较高热稳定性的错配结合蛋白突变体，其可以稳定的特异性性的识别并结合含有错误序列的DNA，从而提高DNA的正确率(参见中国专利申请201910518166.5)。然而，其中的错配结合蛋白突变体是通过与纤维素结合挂柱子的方式纠错，耗时且不利于应用于自动化工作站中从而导致通量低。生物素
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链霉亲和素系统是已知最强的非共价生物学相互作用，解离常数Kd为4x10
‑
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M。其相互作用的强度和特异性使其成为分子，免疫和细胞实验中最广泛使用的亲和对之一(Holmberg et al.,2005)。
[0005]参考文献：
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‑
203.
[0011]6.Hughes,R.A.,Ellington,A.D.Synthetic DNA synthesis and assembly:Putting the synthe本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，为将错配结合蛋白突变体与biotin和EGFP融合后所得；所述错配结合蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1
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853位所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。3.权利要求1或2所述融合蛋白在自动化工作站完成DNA纠错中的应用。4.一种在自动化工作站中进行高通量基因纠错的方法，包括如下步骤：通过链霉亲和素磁珠将权利要求1或2所述融合蛋白进行固定，从而实现在自动化工作站中进行高通量基因纠错；进一步地，进行高通量基因纠错时，反应体系中所述融合蛋白与待纠错的DNA分子的摩尔比为3.75：1。5.一种用于在自动化工作站中进行高通量基因纠错的成套产品，含有权利要求1或2所述融合蛋白和链霉亲和素磁珠。6.生物材料，为如下任一：P1、编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子；P2、含有所述核酸分子的表达盒；P3、含有所述核酸分子的重组载体；P4、含有所述核酸分子的重组细胞。7.权利要求1或2所述融合蛋白的保存方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张佳，朱文轩，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：