用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒和方法。本发明专利技术提供的用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒包含引物组、crRNA、CRISPR

【技术实现步骤摘要】
用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引发的急性肠道传染病，发病急，传播迅速，对公共健康造成不利影响。霍乱弧菌是一种具有单鞭毛的逗号形革兰氏阴性杆状菌，运动活泼，可通过受污染的水和/或食物传播，并引起急性水样腹泻病。按照菌体脂多糖抗原的不同，已分离出210余个血清群，其中霍乱弧菌O1群和O139群产毒株会导致霍乱流行。及早发现和确认霍乱病例对迅速实施干预措施至关重要。根据《霍乱防治手册》(图1)，检测霍乱弧菌O1群和O139群产毒株需要一个耗时且复杂的过程，需要将样本增菌培养后选择性培养，再挑取可疑菌落进行血清学鉴定和PCR检测，整个过程至少要花费两天时间，并且需要良好的实验室基础设施和有经验的工作人员；聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)和实时定量PCR(Quantitative Real
‑
time PCR,qPCR)加快了诊断速度，但依赖昂贵的大型仪器和良好的实验条件，在资源匮乏的偏远地区难以实现，因此快速诊断检测是早期发现产毒霍乱弧菌血清群O1/O139的重要工具。
[0003]CRISPR
‑
Cas(规律间隔成簇短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)系统是广泛存在于古生菌和细菌中的适应性免疫系统，由Cas效应蛋白和CRISPR RNA(crRNAs)组成。CRISPR介导的免疫系统依赖于crRNAs对外源核酸进行序列特异性检测和沉默，从而保护细菌免受病毒和噬菌体的侵袭。到目前为止，许多CRISPR
‑
Cas系统，如Cas9、Cas12、Cas13已被用于诊断功能，由于其高灵活性、敏感性和特异性，在即时检验(point
‑
of
‑
care testing，POCT)中具有较大的潜力。
[0004]重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒温条件下(一般为37℃
‑
42℃)扩增DNA的方法，不需要依赖昂贵的大型仪器。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒以及鉴定产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139的方法。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒，所述试剂盒包含引物组、crRNA、CRISPR
‑
Cas蛋白和ssDNA报告分子；
[0008]所述引物组包含三个引物对，分别针对以下靶基因：霍乱弧菌ctxA基因、O1群霍乱弧菌O抗原编码决定簇特异基因和O139群霍乱弧菌O抗原编码决定簇特异基因；
[0009]所述crRNA包括三个crRNA，分别针对所述三个引物对扩增得到的DNA片段中的靶序列；
[0010]所述CRISPR
‑
Cas蛋白具有切割ssDNA的活性。
[0011]优选地，所述引物对的核苷酸序列如下：SEQ ID NO.1
‑
2、SEQ ID NO.3
‑
4和SEQ ID NO.5
‑
6。
[0012]其中，SEQ ID NO.1
‑
2针对ctxA基因，SEQ ID NO.3
‑
4针对O1群霍乱弧菌O抗原编码基因，SEQ ID NO.5
‑
6针对O139群霍乱弧菌O抗原编码基因。
[0013]上述引物的序列具体如下(5
’‑3’
)：
[0014]SEQ ID NO.1：VC
‑
ctxA
‑
RAA
‑
F：
[0015]TGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATGC；
[0016]SEQ ID NO.2：VC
‑
ctxA
‑
RAA
‑
R：
[0017]CAGTGGCTATAACATATATATAATAAGTAGAAT；
[0018]SEQ ID NO.3：VC
‑
O1
‑
RAA
‑
F：
[0019]AACCCGACCGTTTGGATATCTTCATGTACACT；
[0020]SEQ ID NO.4：VC
‑
O1
‑
RAA
‑
R：
[0021]CTCAAAGATAGCGGAATATGCATTTATTGGC；
[0022]SEQ ID NO.5：VC
‑
O139
‑
RAA
‑
F：
[0023]GGTAAACATATTGGGATTAGCCAGCTCCAAGG；
[0024]SEQ ID NO.6：VC
‑
O139
‑
RAA
‑
R：
[0025]AACTGGGGGCTGAGGTAATTAGTCTGGATCGA。
[0026]本专利技术针对上述靶基因进行了引物的筛选和序列优化，经验证，上述引物对在进行RAA扩增时具有较高的特异性和灵敏度。
[0027]优选地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7
‑
9所示。
[0028]其中，SEQ ID NO.7针对ctxA基因，SEQ ID NO.8针对O1群霍乱弧菌O抗原编码基因，SEQ ID NO.9针对O139群霍乱弧菌O抗原编码基因。
[0029]上述crRNA的核苷酸序列具体如下：
[0030]SEQ ID NO.7：VC
‑
ctxA
‑
crRNA：
[0031]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAUCAUGCAAGAGGAACUCA；
[0032]SEQ ID NO.8：VC
‑
O1
‑
crRNA：
[0033]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACUGUAAUAACACGUUGAUA；
[0034]SEQ ID NO.9：VC
‑
O139
‑
crRNA：
[0035]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUCGCUGAUUAAAGGACGA。
[0036]上述crRNA能够高效引导CRISPR
‑
Cas蛋白与靶序列结合，实现其对ssDNA的切割，显著提高检测的特异性和灵敏度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于产毒型霍乱弧菌血清群O1和O139鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物组、crRNA、CRISPR
‑
Cas蛋白和ssDNA报告分子；所述引物组包含三个引物对，分别针对以下靶基因：霍乱弧菌ctxA基因、O1群霍乱弧菌O抗原编码决定簇特异基因和O139群霍乱弧菌O抗原编码决定簇特异基因；所述crRNA包括三个crRNA，分别针对所述三个引物对扩增得到的DNA片段中的靶序列；所述CRISPR
‑
Cas蛋白具有切割ssDNA的活性。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：SEQ ID NO.1
‑
2、SEQ ID NO.3
‑
4和SEQ ID NO.5
‑
6。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7
‑
9所示。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA报告分子的核苷酸序列为TTATT。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA报告分子的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记猝灭基团，或者，所述ssDNA报告分子的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记生物素。6.根据权利要求1～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas蛋白为Cas12蛋白；优选为Cas12a蛋白。7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自CRISPR反应缓冲液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢盼，逄波，李臻鹏，李哲，阚飙，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：