一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，包括从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或从待检鱼组织中提取DNA，以及设计基于亚种水平的特异引物，以待测样本的DNA为模板，通过上游引物P1与下游引物P2对进行PCR扩增检测，进行电泳分析，通过本发明专利技术能够对在临床上对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种及杀鱼亚种进行准确的区分，在水产养殖中具有较高的应用价值。有较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法。

技术介绍

[0002]美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)分为两个亚种，分别为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselae subsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.piscicida，PDP)，都是广泛分布于海洋环境中的革兰氏阴性致病菌。
[0003]美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染的宿主种类多样，包括甲壳类、鱼类、哺乳类甚至是人类，比如造成甲壳动物结节病，引起鱼类坏死性筋膜炎、造成多个器官衰竭，引起出血症等。而美人鱼发光杆菌杀鱼亚种就目前的报道来看仅感染鱼类。这两种亚种的美人鱼发光杆菌的同源性极强，看家基因gyrB、toxR和ompU都不能精确的区分这两种亚种，甚至二者的16srRNA序列只相差一个碱基，DNA
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DNA杂交相似性达到了80％，导致鉴定美人鱼亚种的难度增加。有文献报道说这两个亚种在某些生化指标上存在着不同，比如精氨酸二氢酶和甲基红等的阳性反应，硝酸盐还原反应，血糖酶的生成量等的测试都能够区别美人鱼法官杆菌美人鱼亚种和杀鱼亚种，但这些生理生化特征在不同的菌株中存在差异，作为鉴别指标极不稳定；也有文献报道，用飞行质谱法区分该亚种，但这种方法费时费力，并且对仪器要求很高；也有用尿素酶基因作为靶标去区分两亚种，但有的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种也存在着尿素酶的基因，导致区分度不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是提供一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，以解决目前常规方法检测不稳定、区分度低的问题。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，包括以下步骤：
[0006]S1：将待测样本的DNA提取；
[0007]S2：基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic di
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GMP phosphodiesterase基因序列作为检测靶序列，以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2，所述P1与P2的序列如下：
[0008]上游引物P1:5'TTGTACTATTTTTAACAAACTTGGCTA 3'，
[0009]下游引物P2:5'CCTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'；
[0010]S3：以待测样本的DNA为模板，通过上游引物P1与下游引物P2对进行实时荧光PCR扩增检测，进行电泳分析，即完成鉴定。
[0011]作为优选的方案，所述步骤S1中，所述将待测样本的DNA提取包括从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或从待检鱼组织中提取DNA。
[0012]作为优选的方案，所述从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA包括以
下步骤：挑取美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落到液体培养基中进行摇床培养过夜，去除上清液后加水混合后，继续离心，再次去除上清液后加水得到混合液，将混合液置于沸水中水浴加热3
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7分钟后取出，再次离心后取上清液，所述上清液即为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种DNA提取液。
[0013]作为优选的方案，所述从待检鱼组织中提取DNA包括以下步骤：取待检测组织进行裂解离心，提取沉淀溶于无菌水即得美人鱼亚种DNA。
[0014]作为优选的方案，所述步骤S3中，所述PCR扩增检测的反应体系为：2
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Taq MasterMix 12.5μl，模板DNA 1μl，ddH2O 9.5μl，10μM的上下游引物各1μl。
[0015]作为优选的方案，所述步骤S3中，所述PCR扩增检测的反应条件为：94℃变性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸2min。
[0016]作为优选的方案，所述步骤S3中，所述电泳分析具体包括：对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具有可见条带的为受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组织，反之则为未受美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染组织。
[0017]本专利技术通过多重全基因组比对技术确定了一段cyclic di
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GMP phosphodiesterase Gmr基因编码的序列，以该序列作为PCR靶标，在美人鱼发光杆菌美人鱼亚种不同菌株内保守而与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种比对存在变异的区域设计一对引物，经检测对PDD不同菌株均具有高灵敏度及特异性。另外，通过对各种实验条件的优化，使得所设计引物能够直接对感染的鱼体组织进行检测，从而达到简单快速特异检测的目的。
附图说明
[0018]图1为以特异性引物Gmr对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种及杀鱼亚种及其它细菌的检测结果图；其中，1为PDD标准株，2、3为PDD分离株，4为PDP标准株，5、6为PDP分离株，7
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11分别为副溶血弧菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌；
[0019]图2为以特异性引物Gmr对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种单菌落和非美人鱼发光杆菌美人鱼亚种单菌落的检测结果图；其中，A1、A2、A3为PDD标准株的单菌落，A4、A5、A6为PDD分离株1的单菌落，A7、A8、A9为PDD分离株2的单菌落，B1、B2、B3为PDP标准株的单菌落，B4、B5、B6为PDP分离株1的单菌落，B7、B8、B9为PDP分离株2的单菌落；
[0020]图3为以特异性引物Gmr对菌落梯度DNA的PCR扩增图；其中，1到8分别是菌株按照10倍的浓度梯度递减后的浓度，初始浓度为177.54ng/μl；
[0021]图4为以特异性引物Gmr对感染美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的鱼组织PCR的特异性扩增图；其中，1为PDD标准株，2、3、4分别为感染PDD银鲳的肝脏、脾脏、肾脏，5、6、7分别为未感染PDD银鲳的肝脏、脾脏、肾脏。
具体实施方式
[0022]下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本专利技术提供一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，包括以下步骤：
[0024]S1：将待测样本的DNA提取；
[0025]S2：基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic di
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GMP phosphodiesterase基因序列作为检测靶序列，以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2，所述P1与P2的序列如下：
[0026]上游引物P1:5'TTGTACTATTTTTAACAAACTTGGCTA 3'，
[0027]下游引物P2:5'CCTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'；
[0028]S3：以待测样本的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将待测样本的DNA提取；S2：基于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的cyclic di
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GMP phosphodiesterase基因序列作为检测靶序列，以其种间及亚种间变异区设计1对种特异引物P1与P2，所述P1与P2的序列如下：上游引物P1:5'TTGTACTATTTTTAACAAACTTGGCTA3'，下游引物P2:5'CCTAATGTTTGTAAGCGAGTTAGCG 3'；S3：以待测样本的DNA为模板，通过上游引物P1与下游引物P2对进行实时荧光PCR扩增检测，进行电泳分析，即完成鉴定。2.根据权利要求1所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述将待测样本的DNA提取包括从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA或从待检鱼组织中提取DNA。3.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测方法，其特征在于，所述从美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落中提取DNA包括以下步骤：挑取美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的单菌落到液体培养基中进行摇床培养过夜，去除上清液后加水混合后，继续离心，再次去除上清液后加水得到混合液，将混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏阳阳，周素明，舒凤玲，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：