一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRISPR/Cas12a检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，所述引物对包括ail

【技术实现步骤摘要】
一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRISPR/Cas12a检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenic Yersinia enterocolitica)是一类重要的食源性致病菌，小肠结肠炎耶尔森菌能够在低温下增殖。人感染后可引起胃肠道症状、呼吸系统、心血管系统等疾病，甚至引起急性阑尾炎、败血症。近年来，由致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的耶尔森氏菌病在全球广泛流行，其中欧洲最为严重，我国在20世纪80年代也遭受过2次由耶尔森氏菌病引起的大流行。根据欧洲食品安全局(EFSA)2015年的一份报告，耶尔森菌病是欧洲最重要的食源性人畜共患病之一。在上世纪80年代中期我国证实有两次大的暴发流行，造成五百多人感染，其原因均为食物污染致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的。在动物屠宰加工过程、运输、销售过程中都可能使肉产品受到污染，包括乳汁也可能被致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌污染。
[0003]传统的细菌检测技术包括病原分离培养、生化鉴定、血清学诊断等，作为检测的“金标准”国标方法已经臻于完善且标准化。但耗时长，单次检出量有限，并因含量低，常规方法灵敏度较难检出。PCR相关方法需经电泳后成像才能读取结果，易因操作不当污染而产生假阳性、费时等缺陷。中国食品安全国家标准GB 4789.8
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2016中规定的食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定方法有冷富集、培养基培养、尿素酶试验、半固体动力试验、革兰氏染色镜检和生化鉴定。这些方法通常与PCR等核酸扩增方法结合使用，导致依赖大型仪器，反应时间长。实际应用上仍待开发灵敏度高，操作简便，实用性强的快速检测技术。为了减少致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的危害，亟待一种检测时间短，灵敏度高，特异性强的检测方法。
[0004]CRISPR/Cas12a受单链RNA(crRNA)引导，特异性结合靶DNA后， Cas12a的结构变化激发其酶活性，不仅可以顺式切割靶标DNA，还可以反式切割非靶标DNA。基于Cas12a的检测成功应用于人乳头瘤病毒(HPV) 的检测，在之后的几年中基于Cas12a的检测层出不穷。2019年复旦大学开发出基于CRISPR/cas12的快速可视化核酸检测平台，解决了气溶胶污染的问题。同一年，Cas12a被用于开发电化学生物传感器不仅提高了灵敏度还增强了便携性。这种传感器被命名为E
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crispr，它使低成本医疗诊断成为可能。 2020年新冠爆发，Cas12a被应用于新型冠状病毒的检测。所以从广度上 Cas12a可以检测细菌，病毒，肿瘤标志物等，从深度上可以比其他方法更精准，灵敏的完成检测。然而CRISPR/Cas12a检测还未应用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用。本专利技术所述引物对灵敏度高，特异性强，能够基于 CRISPR/Cas12a实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测，快速且准确。
[0006]本专利技术提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，所述引物对包括ail
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F和ail
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R，所述ail
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ail
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了上述技术方案所述引物对在制备检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒中的应用。
[0008]本专利技术还提供了一种检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对和反应体系。
[0009]本专利技术还提供了一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对和特异性crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]优选的是，所述试剂盒还包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂。
[0011]优选的是，所述RPA扩增试剂包括RPABasic冻干粉、RPA反应缓冲液和MgOAc。
[0012]优选的是，所述试剂盒包括RPA扩增体系，每50μL的RPA扩增体系包括：4mg RPABasic冻干粉，10μM ail
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F和ail
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R各2.4μL，RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc 2.5μL，2μL模板DNA和DEPC水11.2μL。
[0013]优选的是，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括Cas12a酶、ssDNA荧光猝灭探针和NEBuffer 3.1。
[0014]优选的是，所述ssDNA荧光猝灭探针为在如SEQ ID NO.4核苷酸序列 5
’
端标记有6
‑
FAM且3
’
标记有BHQ
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1的物质。
[0015]优选的是，所述试剂盒包括CRISPR/Cas12a检测体系，每20μL的 CRISPR/Cas12a检测体系包括：1μM Cas12a酶2μL，1μM crRNA 2μL， NEBuffer3.12μL，5μM ssDNA荧光猝灭探针2μL，RPA扩增产物2μL和 DEPC水10μL。
[0016]本专利技术提供了一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对，本专利技术所述引物对能够基于CRISPR/Cas12a实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测，快速且准确，灵敏度高，特异性强。利用本专利技术的试剂盒及检测方法进行致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测，可以实现在45分钟内完成检测，结果实现可视化。本专利技术不需要昂贵的设备，并且减少了诊断的成本和时间进行现场检测。本专利技术的试剂盒具有操作简单、检测快速、特异性强、结果可视化等优点，这对于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测具有重大意义。
附图说明
[0017]图1为本专利技术提供的CRISPR/Cas12a检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的原理图；
[0018]图2为本专利技术提供的针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因的特异性PCR引物的筛选结果图(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；
[0019]图3为本专利技术提供的针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因的特异性RPA引物的筛选结果(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；
[0020]图4为本专利技术提供的不同引物浓度RPA扩增的电泳图；
[0021]图5为本专利技术提供的不同反应温度RPA扩增的电泳图；
[0022]图6为本专利技术提供的不同反应时间RPA扩增的电泳图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括ail
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F和ail
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R，所述ail
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ail
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述引物对在制备检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒中的应用。3.一种检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对和反应体系。4.一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对和特异性crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括RPABasic冻干粉、RPA反应缓冲液和MgOAc。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA扩增体系，每...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢士英，肖毅然，柳溪林，任洪林，胡盼，李岩松，王洋，王菡，王聪，郭禹汐，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：