一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法技术

本申请涉及一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法，所述检测方法包括：对诱导前后的重组工程菌分别进行PCR扩增反应，比较扩增序列的产物，确定质粒是否丢失，计算质粒丢失率。本申请提供的检测质粒丢失率的方法与平板涂布法得到的结果基本一致，且本方法灵敏度高，重复检测结果稳定，能够避免平板涂布法的假阴性的现象。性的现象。性的现象。

【技术实现步骤摘要】
一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法


[0001]本申请涉及基因检测
，尤其涉及一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法。

技术介绍

[0002]重组工程菌表达系统（尤其重组大肠杆菌工程菌）通常含有表达目的蛋白的表达质粒，质粒上会带有抗生素抗性基因，随着传代代次的提高，部分重组工程菌中质粒会发生丢失，失去了抗生素抗性基因，也同时失去表达目的蛋白的能力。因此，质粒丢失后的重组工程菌，在一定浓度的抗生素环境下(如种子培养液)，便不能存活，而在不含抗生素的发酵培养液中，菌体可以正常生长。
[0003]质粒丢失率检测的常规方法为平板涂布培养法，通过在实验过程中比较在含有或不含抗生素培养基的菌体存活数，可以检测质粒的丢失率，从而对质粒稳定性进行一个评价。目前，常用的平板涂布培养法有玻璃珠、细胞铲或者玻璃涂布棒法。玻璃珠法涂布均匀，但是玻璃珠分散，操作回收较麻烦；细胞铲操作比较麻烦，不均匀，容易划破琼脂糖表面；而玻璃涂布棒法虽然操作简单，但是由于平板的琼脂糖表面不平，导致涂布不均匀，多个细胞堆集一起，不能很好的分离形成单一的细菌菌落，从而影响活细菌的计数和阳性细菌克隆的分离，给实验带来不便。另外，受到多种情况影响，采用常规涂布法还可能会出现假阴性的情况。所以提供一种操作简单，检测结果稳定的质粒丢失率检测方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本申请提供了一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法。
[0005]第一方面，本申请提供了一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法，检测方法包括：（1）根据重组工程菌中重组质粒的非转录翻译区设计特异性引物；（2）取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布培养基平板培养，随机挑取培养基平板上≥30个克隆分别进行培养，对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；（3）检测PCR扩增产物结果，计算质粒丢失率，质粒丢失率为无扩增结果克隆数/总克隆数。
[0006]所述发酵终末是指在经过诱导后发酵培养至接近培养结束或培养结束后。
[0007]优选地，所述步骤（2）为：取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素培养基平板培养，随机挑取培养基平板上≥30个克隆至含有抗生素的培养基中分别进行培养，对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；所述抗生素为重组工程菌中包含的抗生素抗性基因对应的抗生素。
[0008]进一步优选地，所述步骤（2）中挑取的克隆数为≥80个，或具体的为100个。
[0009]进一步优选地，步骤（3）中所述检测PCR扩增产物的方法为凝胶电泳法，通过凝胶电泳确定扩增的重组工程菌克隆是否存在扩增产物。
[0010]进一步优选地，所述重组工程菌为重组大肠杆菌工程菌或重组酵母工程菌，更优选为重组大肠杆菌工程菌。
[0011]进一步优选地，所述方法还包括如下步骤：取诱导前菌液保存备用，在步骤（2）中所述保存菌液使用步骤（1）中所述引物进行PCR扩增，作为阳性对照；优选地，所述步骤（2）中还包括以空白宿主菌作为阴性对照。
[0012]作为本申请一种具体的技术方案，步骤（1）为：根据质粒pET
‑
30a(+)的非转录翻译区设计PCR正向引物和反向引物；优选地，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列如下所示：正向引物：TGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTT；反向引物：TGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTT。
[0013]进一步优选地，上述步骤（2）为：取诱导前菌液，保存备用；取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素LB培养基平板培养，随机挑取培养基平板上≥30个克隆接种至96深孔板中进行培养，深孔板中每孔装有含有抗生素的LB培养基，对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；所述抗生素为重组工程菌中包含的抗生素抗性基因对应的抗生素；并以诱导前保存菌液作为阳性对照，以空白宿主菌和/或无菌水作为阴性对照。
[0014]更优选地，所述步骤（2）为：取诱导前菌液，保存备用；取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素LB培养基平板，35
‑
40℃（优选37℃）倒置恒温培养过夜；随机挑取培养基平板上≥30个克隆接种至96深孔板中，深孔板中每孔装有400
‑
600μL含有20μg/mL的Kan（卡那霉素）的LB培养基，35
‑
40℃（优选37℃），180
‑
250 rpm过夜培养；对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；所述抗生素为重组工程菌中包含的抗生素抗性基因对应的抗生素；并以诱导前保存菌液作为阳性对照，以空白宿主菌和/或无菌水作为阴性对照。
[0015]优选地，PCR扩增反应包括预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环等。
[0016]更优选地，PCR扩增反应的条件包括首先95℃预变性3 min，然后94℃变性15 s使DNA双链解开为单链状态，55℃退火15 s使正向引物和反向引物与靶序列配对，72℃延伸45 s，在此条件下进行29个循环，最后72℃再延伸3 min，保持在16℃。
[0017]本申请实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：（1）本申请提供的检测质粒丢失率的方法与平板涂布法得到的结果基本一致；（2）本申请提供的检测方法灵敏度高，重复检测结果稳定，能够避免平板涂布法偶尔出现的假阴性的现象。
附图说明
[0018]图1为本申请实施例2所述菌株进行琼脂糖凝胶电泳检测部分结果，其中最后一条泳道为阳性对照条带。
具体实施方式
[0019]为了能够更清楚地理解本申请的上述目的、特征和优点，下面将对本申请的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0020]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但本申请还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0021]实施例1构建一种表达EK酶的重组工程菌及其发酵表达参照专利CN202210697584.7中实施例1的方法构建重组表达EK酶的工程菌，并于
‑
80℃保存。
[0022]按照专利CN202210697584.7中实施例的方法对制备的重组EK酶工程菌进行诱导表达，制备所述EK酶。
[0023]实施例2检测质粒丢失率在无菌条件下取实施例1中复苏菌液5mL于4℃冰箱保存，作为阳性对照；在无菌条件下取实施例1中发酵结束后的发酵菌液5mL并稀释涂布于无抗LB平板上，37℃倒置恒温培养过夜。次日，随机挑取上述LB平板上单克隆100个分别接种于96深孔板中，深孔板中每孔装有500 μL含终浓度20μg/mL的Kan液体的LB培养基，于37℃，220rpm培养过夜。
[0024]使用设计的PCR引物，以上述过夜培养菌液为模板，进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组工程菌中质粒丢失率的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：（1）根据重组工程菌中重组质粒的非转录翻译区设计特异性引物；（2）取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布培养基平板培养，随机挑取培养基平板上≥30个克隆分别进行培养，对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；（3）检测PCR扩增产物结果，计算质粒丢失率，质粒丢失率为无扩增结果克隆数/总克隆数。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）为：取诱导表达后发酵终末的重组工程菌并涂布无抗生素培养基平板培养，随机挑取培养基平板上≥30个克隆至含有抗生素的培养基中分别进行培养，对培养的每个克隆使用步骤（1）设计的特异性引物进行PCR扩增；所述抗生素为重组工程菌中包含的抗生素抗性基因对应的抗生素。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，王惠，朱志伟，王丽军，
申请(专利权)人：吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：