可逆固定试剂及其使用方法技术

本公开涉及使用在生物分子中含胺部分之间形成双氨基甲酸酯交联的固定试剂对生物样本进行可逆固定的组合物和方法。本进行可逆固定的组合物和方法。本进行可逆固定的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可逆固定试剂及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月23日提交的第62/952,677号美国临时申请和2020年5月18日提交的第63/026,513号美国临时申请的优先权，每一项都通过引用并入本文。


[0003]本公开涉及包含双
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咪唑
‑
羧酸盐化合物的固定试剂组合物以及使用它们来制备可逆固定生物样本的方法。

技术介绍

[0004]含有多种生物分子的生物样本可用于各种目的，例如检测疾病(例如癌症)和/或基因分型(例如物种鉴定)。已开发微流体技术以通过将每个样本(例如，细胞)划分成与其他分区(例如，与其他液滴流体隔离的液滴)分开的离散分区(例如，孔或液滴)来促进处理生物样本。这种划分成离散的分区能够准确控制与生物样本相互作用的各个环境。此外，在离散分区中划分的生物样本可以进行条形码编码，并经受化学或物理过程，例如加热、冷却或化学反应。因此，每个离散的分区可以包含其自己的单独样本，并对其进行单独测定，可定性或定量处理。
[0005]然而，生物样本是不稳定的。当生物样本从其存活的生态位中取出时，立即开始物理分解。分解程度由许多因素决定，包括时间、溶液缓冲条件、温度、来源(例如某些组织和细胞具有更高水平的内源性RNase活性)、生物应激(例如酶促组织解离可以激活应激反应基因)和物理操作(例如移液、离心)。降解包括重要的核酸分子(例如，RNA)、蛋白质，以及分子复合物的高阶3D结构、完整细胞、组织、器官和生物体。生物样本的不稳定性是它们与基于分区的测定(例如，基于液滴或基于孔的单细胞测定)的重要障碍。样本降解极大地限制了在广泛的可用生物样本中准确且可再现地使用此类测定的能力。
[0006]通过使用标准方法固定样本，例如冷冻保存、脱水(例如在甲醇中)、高盐储存(例如使用RNAssist或RNAlater)和/或产生共价交联的化学固定剂(例如多聚甲醛或DSP)，可以缓解生物样本不稳定性的问题。在测定中使用此类固定生物样本的能力，特别是基于分区的测定，需要固定生物样本可以快速有效地解固，以便在样本降解发生之前进行相关测定。
[0007]仍然需要以与基于分区的测定(例如，基于微流体液滴的分析或基于孔的分析)兼容的方式提供生物样本可逆固定的组合物和方法。

技术实现思路

[0008]本公开提供了允许生物样本可逆固定的组合物和方法，以及在基于分区的测定(例如，基于孔或液滴的分析)中使用这些组合物和方法，例如基因表达谱分析。
[0009]在至少一个实施方式中，本公开提供了一种制备生物样本的方法，其包括使样本与包含式(I)化合物的第一固定试剂组合物接触。
[0010][0011]其中，“连接剂(linker)”包含乙二醇部分，和/或2
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24个碳的直链或支链烷烃部分；m为1至12；可选地，其中m＝1。在至少一个实施方式中，“连接剂”包含：(a)2
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24个碳的直链烷烃部分；(b)乙二醇部分；(c)二硫键；和/或(d)支链烷烃部分。
[0012]在该方法的至少一个实施方式中，式(I)化合物是式(II)化合物
[0013][0014]其中，n为1至13。
[0015]在该方法的至少一个实施方式中，式(I)化合物是式(III)化合物
[0016][0017]其中，n为1至12。
[0018]在该方法的至少一个实施方式中，式(I)化合物是式(IV)化合物
[0019][0020][0021]其中，m为1至13，n为1至13。
[0022]在该方法的至少一个实施方式中，式(I)化合物是式(V)化合物
[0023][0024]其中，R选自
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H、
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O(CO)
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CH3和
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O(CO)
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咪唑。
[0025]在该方法的至少一个实施方式中，式(I)的化合物是化合物(6)
[0026][0027]在该方法的至少一个实施方式中，第一固定试剂组合物包含：(a)式(I)化合物，其浓度为50mM或更低、25mM或更低、15mM或更低、10mM或更低，或5mM或更小；和/或(b)DMSO，其浓度为5％或更低、2.5％或更低、或1.5％或更低。在该方法的至少一个实施方式中，在室温(RT)下与第一固定试剂组合物接触3小时或更短、60分钟或更短、30分钟或更短、15分钟或更短、或5分钟或更短。
[0028]在至少一个实施方式中，该方法还包括使样本与第二固定试剂组合物接触；任选地，其中第二固定试剂组合物包含多聚甲醛；可选地，其中多聚甲醛浓度为1％或更低。
[0029]在该方法的至少一个实施方式中，第一固定试剂组合物包含式(II)化合物
[0030][0031]其中，n为1至13；第二固定试剂组合物包含式(III)的化合物：
[0032][0033]其中，n为1至12。
[0034]在该方法的至少一个实施方式中，第一固定试剂组合物包含式(III)的化合物，其中n为1至12；第二固定试剂组合物包含式(II)的化合物，其中n为1至13。
[0035]在该方法的至少一个实施方式中，该方法进一步包括使样本与解固剂接触；任选地，其中解固剂包括：(a)能够裂解氨基甲酸酯键的化合物；任选地，其中所述能够裂解氨基甲酸酯键的化合物选自DETA、EDA、肼一水合物、羧酸酯酶或其组合；(b)能够裂解二硫键的化合物；任选地，其中所述能够裂解二硫键的化合物为DTT；和/或(c)能够逆转多聚甲醛固定的化合物。
[0036]在至少一个实施方式中，本公开还提供了一种包含固定生物样本的组合物，其中该样本包含式(Ia)的交联的生物分子
[0037][0038]其中，X1和X2为样本中相同或不同生物分子的含胺部分。“连接剂”包含乙二醇部分，和/或2
‑
24个碳的直链或支链烷烃部分；m为1到12。在至少一个实施方式中，“连接剂”包含：(a)2
‑
24个碳的直链烷烃部分；(b)乙二醇部分；(c)二硫键；和/或(d)支链烷烃部分。
[0039]在组合物的至少一个实施方式中，固定生物样本包含式(IIa)的交联生物分子
[0040][0041]其中，n为1至13。
[0042]在组合物的至少一个实施方式中，固定生物样本包含式(IIIa)的交联生物分子
[0043][0044]其中，n为1至12。
[0045]在组合物的至少一个实施方式中，固定生物样本包含式(IVa)的交联生物分子
[0046][0047]其中，m为1至13，n为1至13。
[0048]在组合物的至少一个实施方式中，固定生物样本包含式(Va)的交联生物分子
[0049][0050]其中，R选自
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H、
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O(CO)
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CH3和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备生物样本的方法，其包括将所述样本与包含式(I)化合物的第一固定试剂组合物接触其中，“连接剂”包含乙二醇部分，和/或2
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24个碳的直链或支链烷烃部分；m为1至12；任选地，其中：i)m＝1；ii)所述“连接剂”包含2
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24个碳的直链烷烃部分；iii)所述“连接剂”包含乙二醇部分；iv)所述“连接剂”包含二硫键；和/或v)所述“连接剂”包含支链烷烃部分。2.根据权利要求1所述方法，其中，所述式(I)化合物为式(II)化合物其中，n为1至13；任选地，其中，所述式(II)化合物选自化合物(2a)
‑
(2k)
3.根据权利要求1所述方法，其中，所述式(I)化合物为式(III)化合物其中，n为1至12；任选地，其中，所述式(III)化合物选自化合物(3a)
‑
(3f)
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述式(I)化合物为式(IV)化合物其中，m为1至13，n为1至13；任选地，其中，所述式(IV)化合物选自化合物(4a)
‑
(4d)
5.根据权利要求1所述方法，其中，所述式(I)化合物是化合物(V)：其中，R选自
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H、
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O(CO)
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CH3和
‑
O(CO)
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咪唑；任选地，其中，所述式(V)化合物选自化合物(5a)
‑
(5c)
6.根据权利要求1所述方法，其中，所述式(I)化合物是化合物(6)：7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述方法，其中，所述第一固定试剂组合物包括：(a)所述式(I)化合物的浓度为50mM或更低、25mM或更低、15mM或更低、10mM或更低、或5mM或更低；和/或(b)浓度为5％或更低、2.5％或更低或1.5％或更少的DMSO。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述方法，其中，在室温(RT)下与所述第一固定试剂组合物接触3小时或更短、60分钟或更短、30分钟或更短、15分钟或更短、或5分钟或更短。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述样本与第二固定试剂组合物接触；任选地，其中：vi)所述第二固定实试剂组合物包含多聚甲醛；任选地，其中，所述多聚甲醛浓度为1％或更低；vii)所述第一固定试剂组合物包含式(II)的化合物
其中，n为1至13；所述第二固定试剂组合物包含式(III)的化合物其中，n为1至12；viii)所述第一固定试剂组合物包含式(III)的化合物其中，n为1至12；所述第二固定试剂组合物包含式(II)的化合物其中，n为1至13；或者ix)所述第一固定试剂组合物包含式(II)的化合物其中，n为1至13；所述第二固定试剂组合物包含式(V)的化合物：其中，R选自
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H、
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O(CO)
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CH3和
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O(CO)
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咪唑。10.根据权利要求1
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9中任一项所述方法，其中，所述方法还包括使所述样本与裂解剂和/或解固剂接触；可选地，其中，所述解固剂包括：x)一种能够裂解氨基甲酸酯键的化合物；任选地，其中，所述化合物能够裂解选自
DETA、EDA、肼一水合物、羧酯酶或其组合的氨基甲酸酯键；xi)一种能够裂解二硫键的化合物；任选地，其中，能够裂解二硫键的所述化合物为DTT；和/或xii)一种能够逆转多聚甲醛固定的化合物；任选地，其中，能够逆转多聚甲醛固定的所述化合物选自化合物(7a)
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(7o)中的任何一种(7o)中的任何一种11.一种包含固定生物样本的组合物，其中，所述样本包含式(Ia)的交联生物分子
其中，X1和X2是所述样本中相同或不同生物分子的含胺部分；“连接剂”包含乙二醇部分，和/或2
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24个碳的直链或支链烷烃部分；m为1至12；任选地，其中：xiii)m＝1；xiv)所述“连接剂”包含2
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24个碳的直链烷烃部分；xv)所述“连接剂”包含乙二醇部分；xvi)所述“连接剂”包含二硫键；和/或xvii)所述“连接剂”包含支链烷烃部分。12.根据权利要求11所述组合物，其中，所述样本包含：(a)式(IIa)的交联生物分子其中，n为1至13；(b)式(IIIa)的交联生物分子其中，n为1至12；...

【专利技术属性】
技术研发人员：J德兰尼，S戈希尔，A洛韦，Y罗，D沃特，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：