一种骨化三醇有关杂质PZB的分离纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种骨化三醇的有关杂质PZB的分离纯化方法，经分离、鉴定和结构确认，该化合物是骨化三醇在微生物发酵过程中产生的微生物发酵杂质，本发明专利技术通过分离获取该化合物，并对其进行结构确证从而确认该化合物的结构，并公开了HPLC检测方法将其作为骨化三醇有关物质检查时的杂质对照品，从而有效的监控骨化三醇中的有关物质。本发明专利技术的实施有助于骨化三醇质量标准的提高，从而更好的控制骨化三醇的产品质量，对人民群众安全用药具有重要的意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种骨化三醇有关杂质PZB的分离纯化方法


[0001]本专利技术属于化学制药
，具体涉及一种骨化三醇的有关杂质PZB的分离纯化方法以及利用该杂质作为杂质对照品，在骨化三醇原料药和制剂中的检测与分析等质量控制方面的用途。

技术介绍

[0002]骨化三醇(Calcitriol)，化学名为：1，25
‑
二羟胆钙化醇或1，25
‑
二羟维生素D3，结构式为：
[0003][0004]骨化三醇是维生素D3经肝脏和肾脏羟化酶代谢为抗佝偻病活性最强的代谢物。能促进肠道钙的吸收并调节骨质的钙化。骨化三醇最早由瑞士罗氏公司生产，1978年上市，商品名为“Rocaltrol”，用于治疗绝经后骨质疏松、慢性肾功能低下、术后甲状腺功能低下、特发性甲状旁腺功能低下、假性甲状腺功能低下、维生素D依赖性佝偻病、低血磷性维生素D抵抗型佝偻病等。由于骨化三醇是内源性物质，疗效确切、安全稳定，因此是骨质疏松症的首选药物。
[0005]骨化三醇生理活性很高，单次服用剂量极小，一般治疗剂量仅0.25μg/日
‑
1.0μg/日。骨化三醇性质不稳定，对光和热敏感，含有多个手性中心，传统合成路线较长，在合成过程中无可避免的容易产生一些异构体杂质及其它有关物质，难于分离纯化，因而合成工艺技术门槛高、难度大。因此，对原料药和制剂产品的质量控制提出了更高的要求。
[0006]目前，中国药典(2020版)未收载骨化三醇品种，欧洲药典(EP9.0)及美国药典(USP40)中收载了该品种，并控制了杂质包括：骨化三醇前体、反式骨化三醇、1β
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骨化三醇、亚甲基骨化三醇以及骨化三醇前体三唑啉加合物。除此之外，专利CN112552265A公开了一种骨化三醇杂质，属于光反应合成过程中产生的氧化降解杂质。专利CN111978230A公开了一种骨化三醇类化合物，是通过强降解实验产生的杂质。
[0007]本申请骨化三醇的制备工艺区别于传统光化学合成法，是采用微生物发酵法制得，在发酵液提取纯化过程中，意外发现一个含量极高的杂质PZB，含量高达7％以上，且薄层点板发现杂质极位点与骨化三醇相近，采用柱层析、DAC动态制备等纯化方法难以去除。经分离、鉴定和结构确认，该杂质并未被收入上述药典或标准中。因此，确定该杂质的化学结构和制备方法，建立检测方法，分析杂质含量，并确定合理的杂质限度，对保证骨化三醇的产品质量及用药安全性十分必要。

技术实现思路

[0008]为了解决上述问题，本专利技术提供一种骨化三醇的有关杂质PZB的分离纯化方法。
[0009]实现本专利技术的技术方案是：
[0010]本专利技术提供一种骨化三醇的有关杂质PZB的分离纯化方法，杂质PZB为式1所示的化合物：
[0011][0012]所述分离纯化方法包括以下步骤：
[0013](1)发酵工艺：以阿法骨化醇为起始物料，经一步微生物发酵转化成骨化三醇，发酵液提取得到含有式1化合物的骨化三醇粗品；
[0014](2)TBS保护羟基：含有式1的骨化三醇粗品使用有机溶剂溶解，向其中加入TBSCl、咪唑，室温下反应，TLC监测至原料反应完毕，再经柱层析分离，减压浓缩至干得到式3化合物；
[0015](3)脱TBS：式3化合物使用有机溶剂溶解，向其中加入TBAF
·
THF升温至50
‑
60℃进行反应，TLC监测至原料反应完毕，经萃取、柱层析纯化、减压浓缩、烘干后得到白色固体，即式1化合物。
[0016]具体反应式如下：
[0017][0018]在一些实施方式中，步骤(1)中微生物发酵转化方法是将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到将假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于微生物转化式2化合物即起始物料阿法骨化醇。
[0019]在一些实施方式中，步骤(1)中骨化三醇粗品中式1化合物含量为1～10％，优选为2～8％，进一步优选为5～8％。
[0020]在一些实施方式中，步骤(2)中有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯中的一种或几种。
[0021]在一些实施方式中，步骤(3)中有机溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇丙酮、四氢呋喃、二甲醚、乙酸中的一种或几种。
[0022]在一些实施方式中，步骤(2)中柱层析分离采用的洗脱剂为正己烷
‑
乙酸乙酯溶液，具体方法为：正己烷润柱子，湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯＝80:1洗脱杂质，TLC监控，洗脱完毕后，将主点洗脱液于40～50℃减压浓缩干，得到式3化合物。
[0023]在一些实施方式中，步骤(3)中柱层析纯化采用的洗脱剂为正己烷
‑
乙酸乙酯溶液，具体方法为：正己烷润柱子，湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯＝5:1洗脱杂质，1:1分离主产物，TLC监控，洗脱完毕后，将主点洗脱液于40～50℃减压浓缩干，得到式1化合物。
[0024]经本专利技术所述分离纯化方法制得的骨化三醇有关杂质PZB纯品的纯度大于98％，优选大于99％，最优选大于99.8％。
[0025]与现有技术相比，本专利技术涉及的骨化三醇发酵杂质PZB及其制备方法、检测方法和用途的有益效果在于：
[0026](1)本专利技术提供了一种全新结构的骨化三醇的有关杂质PZB，经分离、鉴定和结构确认，该化合物是骨化三醇在微生物发酵过程中产生的微生物发酵杂质，该杂质在骨化三醇的原料发酵液中含量超过了7％，且经传统纯化方式难以去除，给产品安全性带来隐患。本专利技术提供了一种新的杂质制备方式，获得的杂质其高效液相纯度大于等于96.13％，对杂质对照品的制备具有重要的现实意义。
[0027](2)本专利技术通过分离获取该化合物，并对其进行结构确证从而确认该化合物的结构，并公开了HPLC检测方法将其作为骨化三醇有关物质检查时的杂质对照品，从而有效的监控骨化三醇中的有关物质。本专利技术的实施有助于骨化三醇质量标准的提高，从而更好的控制骨化三醇的产品质量，对人民群众安全用药具有重要的意义。
附图说明
[0028]图1为发酵上清液有关物质检测HPLC图谱。
[0029]图2为骨化三醇的有关杂质PZB的HPLC图谱。
[0030]图3为骨化三醇的有关杂质PZB的氢谱。
[0031]图4为骨化三醇的有关杂质PZB的碳谱。
[0032]图5为骨化三醇纯品有关物质检测HPLC图谱。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或
自制获得。
[0034]实施例1微生物转化制备骨化三醇粗品
[0035]本专利技术所述骨化三醇采用微生物发酵法制得，具体制备方法参考专利公开号：CN110527650A中实施例1～5描述的方法获得，以阿法骨化醇为起始物料，经一步微生物发酵转化成骨化三醇粗品。微生物发酵采用的假诺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨化三醇的有关杂质PZB的分离纯化方法，其特征在于，杂质PZB为式1所示的化合物：所述分离纯化方法包括以下步骤：发酵工艺：以阿法骨化醇为起始物料，经一步微生物发酵转化成骨化三醇，发酵液提取得到含有式1化合物的骨化三醇粗品；TBS保护羟基：含有式1的骨化三醇粗品使用有机溶剂溶解，向其中加入TBSCl、咪唑，室温下反应，TLC监测至原料反应完毕，再经柱层析分离，减压浓缩至干得到式3化合物；脱TBS：式3化合物使用有机溶剂溶解，向其中加入TBAF
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THF升温至50
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60℃进行反应，TLC监测至原料反应完毕，经萃取、柱层析纯化、减压浓缩、烘干后得到白色固体，即式1化合物。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中微生物发酵转化方法是将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到将假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于微生物转化式2化合物即起始物料阿法骨化醇。3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中骨化三醇粗品中式1化合物含量为1~10%，优选为2~8%，进一步优选为5~8%。
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【专利技术属性】
技术研发人员：丁伯祥，胡永康，肖昌琴，王雪萌，李聚江，石若鹏，
申请(专利权)人：南京海融制药有限公司，
类型：发明
国别省市：