破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用，本发明专利技术解决了现有材料无法选择性抑制破骨细胞谱系中特定细胞阶段的技术难点。本发明专利技术所述方法采用对破骨前体细胞低渗裂解及匀浆处理得到破骨前体细胞膜，再挤压纳米化后获得破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡。本发明专利技术的细胞膜纳米囊泡含有破骨前体细胞膜表面的蛋白，具有靶向识别及融合能力，赋予靶向破骨前体细胞的功能。本发明专利技术首次提出了一种多核细胞分化谱系中特定分化阶段的细胞膜纳米囊泡，其制备工艺简单，且具有稳定性好，生物相容性好及免疫原性低的特点，说明有利于推广到各类多核细胞的特定分化阶段细胞膜纳米材料用于对应细胞分化谱系的制备领域。备领域。备领域。

【技术实现步骤摘要】
破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物材料及其应用，具体涉及一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法及应用。

技术介绍

[0002]细胞过度多核化激活是各种疾病病理过程中重要的因素，包括溶骨性疾病，慢性感染中的肉芽组织破坏，多核巨细胞的过度炎症反应等。骨质疏松症是临床常见慢性骨骼疾病，其低骨量和严重的骨微组织结构破坏特点，往往会增加骨骼的脆性和易断裂性。作为独特的骨吸收细胞，成熟的多核破骨细胞由于其高转录活性，分泌大量酶和酸发挥骨吸收的功能。然而，破骨细胞的过度多核化会导致骨稳态失衡，从而是引起骨质疏松症的主要因素。目前，对溶骨性疾病的一线治疗，如双膦酸盐，其不加选择地抑制破骨细胞谱系，导致所有骨吸收细胞凋亡，从而破坏必要的骨转换。因此，亟需开发一种材料来选择性靶向破骨细胞谱系中疾病相关特定阶段的破骨前体细胞。
[0003]细胞膜工程化技术已广泛应用于从药物输送、成像到光活化治疗等各种领域。用细胞膜伪装的仿生纳米粒子赋予了类似细胞的功能，从而延长了纳米颗粒在血液中的循环，使它们能够逃脱免疫系统的清除。此外，在癌症治疗中，由于它们从细胞中继承了必要的融合蛋白和粘附分子，癌细胞膜包被的纳米颗粒可以特异性地靶向同源细胞。因此，这些细胞膜材料的同型靶向递送是未来疾病治疗的可用策略。
[0004]然而，尽管细胞膜工程化技术已用于各个领域，但尚未实现在细胞多核化过程中具有特定阶段细胞的选择性靶向递送。破骨前体细胞源自RANKL诱导3天的巨噬细胞，具有参与破骨细胞循环、募集、细胞间识别和融合的特定蛋白质，参与迁移和靶向的蛋白质，如CXCR4、CDC42和RAC2，融合相关蛋白质如CD44和OSCAR。因此，具有特定阶段标记蛋白的细胞膜有助于破骨前体细胞的选择性靶向递送的作用。
[0005]本专利技术中破骨前体细胞膜纳米囊泡，可特异性靶向破骨前体细胞。目前没有这种破骨前体细胞膜材料制备方法及应用的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术是为了解决现有材料不具有高效、特异靶向破骨细胞谱系中特定阶段细胞的技术问题，提供一种具有靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡及其应用。
[0007]为此，本专利技术提供一种靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡，其制备方法如下：
[0008](1)提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M
‑
CSF诱导3
‑
5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3天，获得破骨前体细胞；
[0009](2)洗涤，胰酶消化后，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；
[0010](3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；
[0011](4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35min，得到细胞膜；
[0012](5)将得到的细胞膜用Avanti mini挤出器挤过聚碳酸酯滤膜5～10次，获得可靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡。
[0013]作为优选，所述的哺乳动物单核细胞为6～8周C57BL/6J小鼠胫骨及股骨单核细胞。
[0014]作为优选，所述的胰酶消化后，具体为胰酶消化3～5min后，终止消化并1000rpm，5min离心。
[0015]作为优选，所述的微型注射器为1ml胰岛素注射器。
[0016]作为优选，所述的聚碳酸酯的孔径为100～400nm，进一步优选为100～200nm。
[0017]作为优选，所述的M
‑
CSF浓度为25ng/mL。
[0018]作为优选，RANKL浓度为50ng/mL。
[0019]破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡在体内外靶向破骨细胞谱系中破骨前体细胞的应用。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术的破骨前体细胞膜纳米囊泡材料相比现有骨质疏松药物治疗，本专利技术显著的进步在于：
[0022]1)以破骨前体细胞为原材料，提取的破骨前体细胞膜纳米囊泡具有稳定性好，生物相容性好和免疫原性低的特点，为靶向破骨前体细胞提供了一种有效手段。
[0023]2)破骨前体细胞膜纳米囊泡材料能够保留破骨前体细胞中靶向识别及融合等相关蛋白，具有明显的体内外破骨前体细胞靶向作用，解决了传统药物无选择性破坏破骨细胞谱系问题，从而具有成为骨质疏松治疗的一种高效靶向纳米递送系统前景。
[0024]3)本专利技术的细胞膜纳米递送材料的制备方法操作简单，不会对环境造成污染，安全性好，作为一种高效低毒且具有靶向作用的纳米级递送材料，有望大规模应用于研究和治疗领域。
[0025]4)本专利技术提供的一种多核细胞特定分化阶段的细胞膜纳米材料用于靶向该细胞谱系中特定分化阶段的细胞，为各类多核细胞的药物递送提供研究新思路。
附图说明
[0026]图1是破骨前体细胞膜的Western Blot鉴定图。
[0027]图2是提取的破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡冷冻电镜及粒径分布图。
[0028]图3是通过GO富集分析对比破骨前体细胞膜和巨噬细胞膜蛋白质组学特征。
[0029]图4是破骨前体细胞膜纳米囊泡与破骨前体细胞融合的激光共聚焦共定位结果图。
[0030]图5是破骨前体细胞膜纳米囊泡在小鼠活体成像实验各组织荧光分布及统计图。
[0031]图6是破骨前体细胞膜纳米囊泡在小鼠的股骨组织内与破骨细胞谱系激光共聚焦荧光共定位图。
具体实施方式：
[0032]下面结合实施例对本专利技术提供的一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡材料及其制备方法进行进一步描述，但是不能把以下实施例视为对本专利技术保护范围的限定。
[0033]本专利技术是为了解决现有药物的非特异性破骨细胞谱系靶向问题，提供了一种破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡的制备方法和应用。
[0034]实施例1破骨前体细胞细胞膜纳米囊泡的制备
[0035]破骨前体细胞的收集：取6～8周C57BL/6J老鼠股骨和胫骨，用α
‑
MEM+10％FBS+1％青霉素G和链霉素(完全α
‑
MEM培养基)冲洗骨髓腔，将冲洗后的细胞在含25ng/mL M
‑
CSF的完全α
‑
MEM培养基中培养5天，期间换液一次，获得巨噬细胞。将所得巨噬细胞在含25ng/mL M
‑
CSF及50ng/mL RANKL的完全α
‑
MEM培养基中培养3天得到破骨前体细胞。
[0036]破骨前体细胞膜的制备：将破骨前体细胞洗涤，胰酶消化3min后，终止消本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.破骨细胞前体同源靶向的细胞膜纳米囊泡制备方法，其特征在于,该方法具体包括以下步骤：(1)提取哺乳动物单核细胞，15～30ng/mL M
‑
CSF诱导3
‑
5天得到巨噬细胞，再用30～80ng/mL RANKL诱导3
‑
5天，获得破骨前体细胞；(2)洗涤，胰酶消化后，用4℃的TM缓冲液重悬，所述TM缓冲液为1mM MgCl2和10mM Tris加水混合，并将PH调至7.4；重悬后利用微型注射器挤出30～40次以破坏细胞，得到细胞匀浆；(3)加入1M蔗糖与细胞匀浆混合，达到0.25M蔗糖终浓度；(4)将所述步骤(3)中得到的混合物4℃、2000xg条件下离心10min，收集上清液，4℃、3000xg条件下离心30～35min，用0.25M蔗糖溶液重悬沉淀洗涤，再次4℃、3000xg条件下离心30～35min，得到细胞膜；(5)将得到的细胞膜用挤出器依次挤过400nm及200nm聚碳酸酯滤膜5～10次，获得可靶向破骨前体细胞的细胞膜纳米囊泡。2.根据权利要求1所述的破...

【专利技术属性】
技术研发人员：林贤丰，王清清，王皓立，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属邵逸夫医院，
类型：发明
国别省市：