一种新型的DNA合成连接酶制造技术

本发明专利技术公开了一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；或还包括改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusthermophilus连接酶；制备方法，包括以下步骤：将Taq酶的DNA合成活性结构域，与常温或高温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性，和小片段连接活性；本发明专利技术将大大提高DNA连接酶合成效率。本发明专利技术将大大提高DNA连接酶合成效率。

【技术实现步骤摘要】
一种新型的DNA合成连接酶


[0001]本专利技术涉及连接酶合成
，具体涉及一种新型的DNA合成连接酶。

技术介绍

[0002]DNA连接酶对于维持体内细胞的基因组完整性起了至关重要的作用，是DNA代谢的关键酶，它们催化的反应(缺口DNA的连接)在DNA复制和DNA修复途径中都是必需的，除此以外还具备有DNA的核酸切除修复、碱基缺失修复以及单双链的断裂修复等各种修复功能。
[0003]常见的DNA连接酶可分为高温适宜和常温适宜活性。常温DNA连接酶中常用主要包括例如E.coliDNA连接酶、T3DNA连接酶、T4DNA连接酶以及T7DNA连接酶在内的几种，他们适合的反应温度为37℃以下，更多的用于常温下的连接实验，特异性较低，但反应速率较快，需要的环境容易达到。
[0004]Thermusaquaticus(Taq)连接酶、9
°
N连接酶、Thermusthermophilus(Tth)连接酶、Thermotogamaritima(Tma)连接酶。这些酶的反应温度都比较高，基本都高于45℃，甚至有些达到了65℃，且在90℃环境下也不能失活，因此将之称为嗜热高温连接酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就在于解决上述
技术介绍
的问题，而提出一种新型的DNA合成连接酶。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；
[0008]DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
[0009]将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与T4连接酶或T7连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性和小片段连接活性。
[0010]作为本专利技术进一步的方案：还包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusthermophilus连接酶：
[0011]其中，DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
[0012]将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与Thermusaquaticus连接酶或Thermusthermophilus连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：基因优化至大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI
‑
XhoI。
[0014]作为本专利技术进一步的方案：改性TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
[0015]将双醛葡聚糖水溶液加入至TaqDNA聚合酶的吸附反应液中，进行交联反应，然后
加入至氯化钾溶液中，静置，洗涤，得TaqDNA聚合酶的交联反应液；
[0016]将TaqDNA聚合酶的交联反应液与木浆海绵进行混合，加入浓度为30g/L的PCR反应促进剂，1000rpm离心，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，至洗涤液中检测不出游离的TaqDNA聚合酶。
[0017]作为本专利技术进一步的方案：PCR反应促进剂的制备方法，包括以下步骤：
[0018]步骤2：改性壳聚糖加入到蒸馏水中，室温搅拌2h；姜黄素加入到乙醇中，在搅拌下，逐滴加入到壳聚糖溶液中，透析，得到PCR反应促进剂。
[0019]作为本专利技术进一步的方案：改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
[0020]将壳聚糖溶于DMSO中；在室温的条件下再加入六氢苯酐；升温至80℃反应；调pH、抽滤、透析，即得到改性壳聚糖。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]通过壳聚糖水溶性处理，并与姜黄素反应，得到PCR反应促进剂该具有很强抗氧化能力；再以该PCR反应促进剂制备得到活力高，热稳定性好的TaqDNA聚合酶；从而提高DNA连接酶合成的效率。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术实施例中，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]实施例1
[0025]本专利技术为一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；
[0026]其中，一种新型的DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
[0027]将Taq酶的DNA合成活性结构域，与常温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白。使其同时具有DNA片段合成活性(来自Taq序列)，和小片段连接活性(来自连接酶序列)；提高大片段DNA的合成效率；
[0028]基因优化至适合大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI
‑
XhoI。
[0029]实施例2
[0030]本专利技术为一种新型的DNA合成连接酶，包括改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶+柔性linker+Thermusthermophilus连接酶：
[0031]其中，一种新型的DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：
[0032]将Taq酶的DNA合成活性结构域，与高温连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白。使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。其连接效率较之低温的连接酶要低，优势在于可以提高大片的DNA合成过程中的保真性；
[0033]基因优化至适合大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表达载体pET22b+中，酶切位点为NdeI
‑
XhoI。
[0034]实施例3
[0035]改性TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
[0036]将50mL的体积分数为0.05％的双醛葡聚糖水溶液加入至TaqDNA聚合酶的吸附反应液中，进行交联反应，反应温度为32℃，反应时间为90min，然后加入至氯化钾溶液中，静置，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液进行洗涤，得TaqDNA聚合酶的交联反应液；
[0037]将TaqDNA聚合酶的交联反应液与木浆海绵进行混合，加入浓度为30g/L的PCR反应促进剂，1000rpm离心，然后用含有0.5mol/L氯化钠的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型的DNA合成连接酶，其特征在于，包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T4连接酶；或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker和T7连接酶；DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与T4连接酶或T7连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使其同时具有DNA片段合成活性和小片段连接活性。2.根据权利要求1所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，还包括改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusaquaticus连接酶，或改性TaqDNA聚合酶、柔性linker、Thermusthermophilus连接酶：其中，DNA合成连接酶的制备方法，包括以下步骤：将改性TaqDNA聚合酶的DNA合成活性结构域，与Thermusaquaticus连接酶或Thermusthermophilus连接酶的连接结构域，以柔性linker加以连接，形成融合的双功能蛋白；使得融合蛋白同时具有DNA合成活性，小片段连接活性。3.根据权利要求1或2所述的一种新型的DNA合成连接酶,其特征在于，基因优化至大肠杆菌表达，并进行基因合成后连接至表...

【专利技术属性】
技术研发人员：李森，张伦，雍德祥，孙伟，
申请(专利权)人：通用生物南京有限公司，
类型：发明
国别省市：