三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用技术

本申请涉及尿源干细胞技术领域，尤其涉及三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用。该方法包括以下步骤：获得人尿源性干细胞和凝胶前体溶液；将人尿源性干细胞接种于凝胶前体溶液，再向溶液中滴入β

【技术实现步骤摘要】
三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用


[0001]本申请涉及尿源干细胞
，尤其涉及三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用。

技术介绍

[0002]尿源干细胞(Urine
‑
derived stem cells，USCs)人尿液中具有良好增殖活性和多向分化能力的成体干细胞，约占尿液中存活细胞的0.2％，具有间充质干细胞的各种生物学特性。具有来源广泛、取材安全、操作简单、成本低、自我更新和多向分化能力强等优点，是再生医学理想的种子细胞来源。
[0003]目前细胞治疗和组织工程处于快速发展期，人们已经开始探索利用hUSCs来实现疾病治疗、组织再生或器官重建，例如利用hUSCs、进行个体化的肾遗传疾病的治疗，将用hUSCs与p
‑
TCP结合可以应用于骨再生、通过激活信号通路的Wnt/p
‑
catenin诱导用hUSCs、为成骨细胞、移植过表达血管内皮生长因子的自体用hUSCs、重建泌尿生殖器等。除了人尿源干细胞本身有多种用途，hUSCs还可以重编程为高质量的诱导多能干细胞，给用hUSCs的临床应用带来光明前景。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请的目的在于提供一种重编USCs及其重编培养方法，以将重编USCs应用一些新领域，拓宽其应用前景。
[0005]第一方面，本申请实施例公开了一种人尿源性干细胞的三维重编培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0006]获得人尿源性干细胞和凝胶前体溶液，所述凝胶前体为耦合了人血管生成素相关生长因子的粘附多肽和卡托普利的壳聚糖；
[0007]将所述人尿源性干细胞接种于所述凝胶前体溶液，再向溶液中滴入β
‑
甘油磷酸钠水溶液，迅速转至加湿培养箱中处理，即可得到三维凝胶微粒；
[0008]更换传代培养基进行重编培养，每48小时更换一次新鲜传代培养基，共更换3～5次。
[0009]在本申请实施例中，所述传代培养基是以DMEM/F12为基础培养液，包含0.25v/v％胎牛血清，0.15μg/mL庆大霉素、0.075ng/mL两性霉素、0.5v/v％人表皮生长因子、5μg/mL胰岛素、0.5v/v％皮质醇、0.05mg/mL转铁蛋白、0.5v/v％三碘甲状腺氨酸和0.05μg/mL肾上腺素。
[0010]在本申请实施例中，所述凝胶前体的合成方法包括：
[0011]合成叠氮粘附多肽，所述粘附多肽的氨基酸序列为Arg
‑
Gly
‑
Asp
‑
Ser；
[0012]合成炔基壳聚糖，所述戊炔酸缩合至壳聚糖的氨基侧链上；
[0013]合成壳聚糖
‑
叠氮
‑
粘附多肽，是将所述叠氮粘附多肽通过点击反应连接至所述炔
基壳聚糖得到；
[0014]合成所述凝胶前体，是将所述壳聚糖
‑
叠氮
‑
粘附多肽与卡托普利缩合得到的。
[0015]在本申请实施例中，合成所述叠氮粘附多肽的步骤包括：
[0016]将通过固相合成的方法，将侧链被tert
‑
buty基团保护且氨基被Fmoc保护的氨基酸依次接肢在树脂上，并最后将叠氮化已酸连接肢多肽链的氨基上，并最终用三氟乙酸处理树脂，得到所述叠氮粘附多肽。
[0017]在本申请实施例中，合成炔基壳聚糖的步骤包括：
[0018]将壳聚糖溶解于蒸馏水中，向其中加入戊炔酸，利用1M盐酸(HCL)和1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节PH值使CS完全溶解，得到CS溶液；
[0019]将1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，吉尔生化(上海)有限公司)按照EDC:戊炔酸＝3:1的比例分3次加入CS溶液中，每30min加1次，置于冰浴处理反应24h；
[0020]于4℃条件对产物进行透析，依次采用5mM HCl和1wt％NaCL的混合溶液透析2天；3mM HCL透析1天、1mMHCL透析2天和去离子水透析3天，冻干，即可获得炔基
‑
壳聚糖；炔基基团连接在壳聚糖的氨基侧链上。
[0021]在本申请实施例中，所述凝胶前体溶液中含凝胶前体浓度为5～100nM，对应的所述β
‑
甘油磷酸钠水溶液的浓度位0.1～2M。
[0022]在本申请实施例中，所述凝胶前体溶液还包含50mMTris、50mM氯化钙、10U/mL凝血酶激活因子XIIIa。
[0023]第二方面，本申请实施例公开了第一方面涉及的三维重编培养方法得到的重编人尿源性干细胞，低表达凋亡相关基因，高表达血管相关基因。
[0024]第三方面，本申请实施例公开了第一方面的三维重编培养方法得到的重编人尿源性干细胞在制备糖尿病创面药物中的应用。
[0025]第四方面，本申请实施例公开了第一方面的三维重编培养方法得到的重编人尿源性干细胞在制备降压药物中的应用。
[0026]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0027]本申请实施例通过合成了一种连接有RGD多肽和卡托普利的三维基质，并利用该三维基质对人尿源性干细胞进行重编培养，使得该细胞具有超强的增殖能力、抗凋亡能力，并能够一定量表达血管促生相关基因和血管紧张素转移酶2基因的分化功能，并且通过动物实验证实了三维重编后的人尿源性干细胞具有愈合糖尿病创面模型鼠的创面和降低高血压的功能，为其作为糖尿病创面愈合和降压相关药品的应用领域提供广泛的应用前景。
附图说明
[0028]图1为本申请实施例分离得到的人尿源性干细胞的原代细胞镜检图。
[0029]图2为本申请实施例分离得到的人尿源性干细胞的第4代细胞镜检图。
[0030]图3为本申请实施例合成的相关凝胶前体物质的FTIR图谱。
[0031]图4为本申请实施例提供的CS分子结构示意图。
[0032]图5为本申请实施例提供的CS
‑
N3
‑
RGD分子结构示意图。
[0033]图6为本申请实施例提供的CS
‑
N3
‑
RGD
‑
Cap分子结构示意图。
[0034]图7为本申请实施例1提供的三维重编培养后分离的USCs镜检图。
[0035]图8为本申请对比例1提供的三维重编培养后分离的USCs镜检图。
[0036]图9为本申请对比例2提供的三维重编培养后分离的USCs镜检图。
[0037]图10为本申请实施例1提供的三维重编培养后分离的USCs的成骨诱导的Vonkossa染色镜检图。
[0038]图11为本申请对比例1提供的三维重编培养后分离的USCs的成骨诱导的Vonkossa染色镜检图。
[0039]图12为本申请对比例2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人尿源性干细胞的三维重编培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获得人尿源性干细胞和凝胶前体溶液，所述凝胶前体为耦合了人血管生成素相关生长因子的粘附多肽和卡托普利的壳聚糖；将所述人尿源性干细胞接种于所述凝胶前体溶液，再向溶液中滴入β
‑
甘油磷酸钠水溶液，迅速转至加湿培养箱中处理，即可得到三维凝胶微粒；更换传代培养基进行重编培养，每48小时更换一次新鲜传代培养基，共更换3～5次。2.根据权利要求1所述的三维重编培养方法，其特征在于，所述传代培养基是以DMEM/F12为基础培养液，包含0.25v/v％胎牛血清，0.15μg/mL庆大霉素、0.075ng/mL两性霉素、0.5v/v％人表皮生长因子、5μg/mL胰岛素、0.5v/v％皮质醇、0.05mg/mL转铁蛋白、0.5v/v％三碘甲状腺氨酸和0.05μg/mL肾上腺素。3.根据权利要求1所述的三维重编培养方法，其特征在于，所述凝胶前体的合成方法包括：合成叠氮粘附多肽，所述粘附多肽的氨基酸序列为Arg
‑
Gly
‑
Asp
‑
Ser；合成炔基壳聚糖，所述戊炔酸缩合至壳聚糖的氨基侧链上；合成壳聚糖
‑
叠氮
‑
粘附多肽，是将所述叠氮粘附多肽通过点击反应连接至所述炔基壳聚糖得到；合成所述凝胶前体，是将所述壳聚糖
‑
叠氮
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粘附多肽与卡托普利缩合得到的。4.根据权利要求3所述的三维重编培养方法，其特征在于，合成所述叠氮粘附多肽的步骤包括：将通过固相合成的方法，将侧链被tert
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buty基团保护且氨基被Fmoc保护的氨基酸依次接肢在树脂上，并最后将叠氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：付荣，
申请(专利权)人：广东旺合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：