产生造血干细胞的方法技术

在各方面和实施方案中，本公开提供用于使内皮细胞转变为生血内皮(HE)细胞、和用于使HE细胞转变为HSC、包括含有显著水平的LT

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生造血干细胞的方法
[0001]优先权声明
[0002]本申请要求2019年12月9日提交的美国临时专利申请系列号62/945,838的权益。前述的完整内容通过引用并入本文。
[0003]联邦赞助的研究或开发
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号HL131645下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的一定的权利。

技术介绍

[0005]造血干细胞(HSC)是在胚胎发生期间在不同区域衍生的，在所述区域中特定的诱导事件将中胚层转化为血液干细胞和祖细胞。HSC可以在称为造血作用(hematopoiesis)的过程中引起红细胞、血小板、骨髓和淋巴(T
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&B细胞)细胞。
[0006]HSC移植(HSCT)被广泛用于治疗患有血液、骨髓、代谢、和免疫疾病的患者。尽管脐带和单倍体相合(haplo
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identical)干细胞移植取得了进展，但由于难以及时找到合适的人白细胞抗原(HLA)匹配的供体，因此HSC移植的治疗用途常常受到限制，特别是在少数族裔和缺乏国家无关供体登记的国家。尽管混合种族人口占美国人口的1.6％(970万)，但多种族志愿者仅占登记册中700万人中的3％(21,000)，使6,000名患者无法进行骨髓匹配。即使找到合适的匹配，免疫系统并发症如移植物抗宿主病(GVHD)、供体排斥、以及与治疗有关的高死亡率也可危及患者的生存。然而，这些并发症通过自体移植消除。尽管自体HSC不会完全替代同种异体HSC，尤其是在血液系统恶性肿瘤的情况下，但它们将克服HSCT中的主要障碍，包括对于患有广泛恶性和非恶性血液、免疫、和代谢异常的患者缺乏供体可用性和GVHD。
[0007]因此，需要产生用于HSCT的HSC，包括自体HSC或即需即用HSC(off
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the
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shelf HSC)。

技术实现思路

[0008]本公开至少部分地基于以下发现：某些内皮基因和造血基因的表达或活性的变化诱导自内皮细胞的造血干细胞(HSC)形成，包括形成大量的可自我更新、定植(engraft)、并重建多谱系成体血液的长期(LT)
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HSC。
[0009]cdh5
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吗啡啉突变体(morphant)(cdh5
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MO)胚胎在无心输出量(cardiac output)和活跃血液流动(active blood flow)的血管中具有心跳介导的脉动。脉动来源的拉伸激活Piezo1机械敏感通道，进一步增强了主动脉
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性腺
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中肾(AGM)区域中的Dnmt3表达，并且这反过来调节核心内皮基因和造血基因以及它们的调节子的表达以刺激生血内皮细胞
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至
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HSC转变。脉动的模拟或Piezo1的药理激活还产生两倍至三倍更高量的LT
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HSC，这些LT
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HSC在连续移植的情况下重建为正常的功能性多谱系成体血液。在一些实施方案中，根据本公开生产的造血干细胞包含大量的表现优异定植并在接受者(recipient)中重建为功能性的多谱系成体血液的LT
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HSC。
[0010]在一些实施方案中，本专利技术提供制备包括LT
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HSC的造血干细胞(HSC)的群体的方法。所述方法包括提供包括内皮细胞和/或生血内皮(HE)细胞的细胞的群体，和在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种、三种、四种、五种或更多种内皮基因的表达或修饰其活性。所述方法进一步包括在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种、三种、四种、五种或更多种造血基因的表达或修饰其活性。通过降低内皮基因的表达或活性，并通过增加造血基因的表达或活性，刺激HE细胞或HSC(包括大量的LT
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HSC)的形成。可直接降低内皮基因的表达或活性，增加造血基因的表达或活性，例如通过施用抑制剂、转基因、附加体、mRNA及其衍生物、和/或使用基因编辑方法(如本文中更充分描述的)。可选地，可至少部分地间接地诱导表达或活性的此类变化，例如通过增加DNA(胞嘧啶
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)
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甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTPase IMAP家族成员6(Gimap6)的表达或活性。此外，可通过使用机械敏感受体或通道的激动剂(例如，Piezo1激动剂)、或通过向细胞施加循环应变生物力学拉伸来至少部分地进行此类基因表达调节。在各种实施方案中，直接或间接地降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的至少一种或至少两种、三种、四种、五种或更多种内皮基因的表达。在这些或其它实施方案中，直接或间接地增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的至少一种或至少两种、三种、四种、五种或更多种造血基因的表达。
[0011]在一些实施方案中，通过在足以刺激HE细胞或HSC的形成的条件下、在细胞中增加Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达来至少部分地调节内皮基因和造血基因的表达或活性。在一些实施方案中，回收HE细胞并用于HSC的形成。可回收HSC并任选地扩增用于施用至患者。HSC是使用本文所述的基因、药理学、或机械刺激任选地扩增的。
[0012]在一些实施方案中，内皮细胞与有效量的增加Dnmt3b的活性或表达、或提供内皮基因和造血基因的适当调节的激动剂接触。在一些实施方案中，激动剂是机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂。在一些实施方案中，机械敏感受体是Piezo1。示例性的Piezo1激动剂包括Yoda1、Jedi1、和Jedi2。在一些实施方案中，Piezo1激动剂(例如，Yoda1)的有效量在约0.1μM至约300μM、或约0.1μM至约200μM、或约1μM至约100μM的范围内，或者在一些实施方案中，在约10μM至约100μM、或约2.5μM至约100μM或约2.5μM至约50μM的范围内。
[0013]替代的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂(例如，Piezo1激动剂)可从化学文库中鉴定出。在这些实施方案中，鉴定出如本文所述诱导内皮基因和造血基因表达的变化的激动剂。例如，在与候选化合物接触的情况下，候选激动剂在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的内皮基因的表达或修饰其活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或修饰其活性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备包括长期(LT)
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HSC的造血干细胞(HSC)的群体的方法，所述方法包括：提供包括内皮细胞和/或生血内皮(HE)细胞的群体，在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的两种或更多种内皮基因的表达或活性；在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激包括LT
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HSC的HSC的形成。2.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或更多种内皮基因的表达或活性；和在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的三种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激HSC的形成和任选地扩增。3.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述内皮细胞和/或HE细胞中降低vegfa、hey2、grp116、gna13、cdh5、和plxnd1的表达或活性；和在所述内皮细胞和/或HE细胞中增加runx1、spi1、cebpa、tal1、和gata2的表达或活性，从而刺激HSC的形成和任选地扩增。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述增加造血基因的活性或表达包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述造血基因、将编码转基因或附加体引入所述造血基因、和将表达元件的基因修饰引入所述造血基因或将功能获得型突变引入所述造血基因。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性包括以下的一种或更多种：将完整或部分的基因删除、RNA沉默、反义寡核苷酸抑制、药理学抑制引入所述内皮基因，和将表达元件的基因修饰引入所述内皮基因或将功能丧失型突变引入所述内皮基因。6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Dnmt3b的表达或活性来进行的。7.根据权利要求6所述的方法，其中增加Dnmt3b的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Dnmt3b基因、将编码转基因或附加体引入所述Dnmt3b基因、和将表达元件的基因修饰或功能获得型突变引入所述Dnmt3b基因。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Gimap6的表达或活性来进行的。9.根据权利要求8所述的方法，其中增加Gimap6的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Gimap6基因、将编码转基因或附加体引入所述Gimap6基因、和将表达元件的基因修饰或功能获得型突变引入所述Gimap6基因。10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过使内皮细胞或HE细胞与2D或3D循环应变、有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂、或其组合接触来进行的。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述Piezo1激动剂是Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1至500uM的范围内、或在0.1至100μM的范围内。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述Piezo1的激动剂基于以下在化学文库中鉴定：在与候选化合物接触的情况下，在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的内皮基因的表达或活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法包括将包括拟胚体、内皮细胞、生血内皮(HE)细胞、或其组合的群体提供至生物反应器。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物反应器提供循环应变生物力学拉伸、有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂、或其组合。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述循环应变生物力学拉伸在内皮细胞和/或HE细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的三种或更多种内皮基因的表达或活性；和在内皮细胞和/或HE细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性，从而刺激HSC的形成、和任选地扩增。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述HSC定植在造血龛中并重建为功能性多谱系成体血液。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中HE细胞获得自诱导性多能干细胞(iPSC)、非造血干细胞、体细胞、或内皮细胞。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞包括至少1％长期造血干细胞(LT
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HSC)、或至少5％LT
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HSC。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述造血干细胞包括至少0.1％长期造血干细胞(LT
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HSC)。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞和/或HE细胞源自HLA
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修饰的细胞或HLA
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空白细胞、和/或无转基因的细胞、基因校正的、转基因过表达的，并且任选地通过iPS细胞或体细胞的基因或化学诱导衍生。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中源细胞获得自或源自受试者、即需即用细胞文库，其中所述受试者任选地为通用相容供体。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述源细胞获得自或源自患有血液、骨髓、溶酶体储存、线粒体、代谢或免疫疾病的受试者。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者不患有血液系统或非血液系统恶性肿瘤。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其还包括回收和任选地扩增所述HSC。26.根据权利要求25所述的方法，其中将所述HSC的群体施用至接受者，其中所述接受者任选地为供体受试者。27.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约102个HSC。28.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约103个HSC。29.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约104个HSC。30.根据权利要求26所述的方法，其中施用至少约105个HSC。31.一种将细胞群体转变为生血内皮(HE)细胞的方法，所述方法包括：
提供包括拟胚体或内皮细胞的群体，并提供选自以下的一种或更多种的基因、药理学、和/或机械刺激：在所述细胞中降低选自vegfa、hey2、grp116、gna13、sox17、cdh5、plxnd1、bcl6、和apln的一种或更多种内皮基因的表达或活性；和在所述细胞中增加选自runx1、spi1、cebpa、tal1、gfi1、gata2、和mllt3的两种或更多种造血基因的表达或活性；施加2D或3D循环应变，和将所述细胞与有效浓度和持续时间下的Piezo1的激动剂接触；从而将所述细胞转变为HE细胞。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述增加造血基因的活性或表达包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述造血基因、将编码转基因或附加体引入所述造血基因，将表达元件的基因修饰引入所述造血基因；和将功能获得型突变引入所述造血基因。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性包括以下的一种或更多种：将完整或部分的基因删除、RNA沉默；反义寡核苷酸抑制、药理学抑制引入所述内皮基因，将表达元件的基因修饰引入所述内皮基因、和将功能丧失型突变引入所述内皮基因。34.根据权利要求33或33所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Dnmt3b的表达或活性来进行的。35.根据权利要求34所述的方法，其中增加Dnmt3b的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Dnmt3b基因、将编码转基因或附加体引入所述Dnmt3b基因、将表达元件的基因修饰引入所述Dnmt3b基因、和将功能获得型突变引入所述Dnmt3b基因。36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述降低内皮基因的表达或活性和所述增加造血基因的表达或活性是通过增加有效水平和持续时间下的Gimap6的表达或活性来进行的。37.根据权利要求36所述的方法，其中增加Gimap6的表达或活性包括以下的一种或更多种：将编码mRNA或mRNA衍生物引入所述Gimap6基因、将编码转基因或附加体引入所述Gimap6基因、将表达元件的基因修饰引入所述Gimap6基因、和将功能获得型突变(一种或更多种)引入所述Gimap6基因。38.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞与有效量的选自Yoda1、Jedi1、和/或Jedi2的Piezo1激动剂接触。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Piezo1激动剂的有效量在0.1至500uM的范围内、或在0.1至100μM的范围内。40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述群体提供至生物反应器，其中所述生物反应器提供循环应变生物力学拉伸。41.根据权利要求40所述的方法，其中将所述HE细胞回收，或将所述HE细胞转变为HSC，所述转变任选地通过施加所述基因、药理学、和/或机...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：布里格姆妇女医院，
类型：发明
国别省市：