本发明专利技术公开了一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法，相较于以往的单批次发酵，本发明专利技术方法将发酵完成的菌液按照一定体积比例留在发酵罐中，通过与LB培养基混合培养，重新形成大量种子液，再次进行发酵。该方法减少了单批次种子液扩繁的步骤，直接利用上一批次的菌液作为种子液扩大培养，降低种子液制备成本；同时减少了发酵罐的清洗、消毒过程，提高发酵罐的利用率，产能增加0.5～1.5倍。产能增加0.5～1.5倍。
【技术实现步骤摘要】
一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法
[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法。
技术介绍
[0002]聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景。
[0003]现有PHA的生产以微生物发酵为主，传统的PHA发酵工艺已经比较成熟，经改良后的盐单胞菌发酵48h的PHA积累量可达70％以上，然而PHA生产过程产生废水的处理问题却难以彻底解决，这已成为限制PHA发酵生产发展的瓶颈问题。PHA的发酵时间也相对较长，整体的发酵效率较低，这导致PHA的生产成本居高不下，制约了PHA的应用范围。
[0004]盐单胞菌是常用的PHA发酵菌株，CN111349662A、CN111500650A、CN111394398A、CN113801810A等公开了不同使用盐单胞菌生产PHA的工艺。这些生产工艺在一定程度上提高了PHA的产量，但是依然分批发酵，单次发酵的时间一般长达48h，批次间隔一般为24h，每次发酵都需要重新准备种子液，生产成本依然较高。
[0005]开发出一种高效的PHA发酵工艺，具有非常重要的意义。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法。
[0007]本专利技术所采取的技术方案是：一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法，包括：S1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；S2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/L后，依次补充补料A、补料B和补料C，控制糖浓度在5～15g/L；补料C补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/L，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取PHA；S3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复S2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/L，酵母粉2～5g/L，尿素30～50g/L，玉米浆干粉30～40g/L；补料A的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，尿素27.72～44.35g/L；补料B的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，硫酸铵5～8g/L；补料C的组分主要为：葡萄糖800g/L。
[0008]在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至
10：90。
[0009]在一些方法的实例中，步骤S4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
[0010]在一些方法的实例中，步骤S2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/L时，进行补料操作。
[0011]在一些方法的实例中，步骤S2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/L。
[0012]在一些方法的实例中，步骤S2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/L时，进行补料操作，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/L。
[0013]在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L, 无水氯化钙0.015 g/L，七水硫酸锌0.1mg/L，四水硫酸锰0.03mg/L，硼酸0.3mg/L，六水氯化钴0.2mg/L，五水硫酸铜0.01mg/L，氯化镍六水合物0.02mg/L，钼酸钠0.03mg/L。
[0014]在一些方法的实例中，所述补料A的体积是步骤S1)中发酵基础培养基体积的8～15%。
[0015]在一些方法的实例中，所述补料B的体积是步骤S1)中发酵基础培养基体积的6～10%。
[0016]在一些方法的实例中，所述补料C的体积是步骤S1)中发酵基础培养基体积的10～15%。
[0017]在一些方法的实例中，步骤S2)中，放出部分菌液占菌液总体积的70～90%。
[0018]在一些方法的实例中，重复培养的批次不超过20次。
[0019]本专利技术的有益效果是：本专利技术一些实例的方法，可以节约单批次发酵后的清洗、消毒时间，提高了发酵罐的利用效率，同时节省了种子液的制备过程，产能提高约0.5～1.5倍。
具体实施方式
[0020]专利技术人研究意外发现，盐单胞菌单批次发酵后期菌体内富含PHA颗粒，且菌体长度增加，在将一定体积的菌液接种到LB培养基中，菌体可再次恢复快速分裂能力，菌体内PHA颗粒在分裂过程中略有损耗，且新产生的盐单胞菌菌体内不含有PHA颗粒。基于盐单胞菌的此特点，提供该盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法。
[0021]一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法，包括：S1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；S2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/L后，依次补充补料A、补料B和补料C，控制糖浓度在5～15g/L；补料C补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/L，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取PHA；S3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复S2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/L，酵母粉2～5g/L，尿素30～50g/L，玉米浆干粉30～40g/L；补料A的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，尿素27.72～44.35g/L；
补料B的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，硫酸铵5～8g/L；补料C的组分主要为：葡萄糖800g/L。
[0022]在一些方法的实例中，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
[0023]在一些方法的实例中，步骤S4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。
[0024]在一些方法的实例中，步骤S2)中，菌液中的含糖量降至10～15g/L时，进行补料操作。为了使得培养基中组分保持基本稳定，补料时优选流加。
[0025]在一些方法的实例中，步骤S2)中，补料操作时控制菌液中的含糖量为8～15g/L。这样更有利于提高PHA的产量。
[0026]为了满足菌株生长的需要，发酵基础培养基中还添加有微量元素。在一些方法的实例中，所述发酵基础培养基还添加微量元素，具体为硫酸镁0.2 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L, 无水氯化钙0.015 g/L，七水硫酸锌0.1mg/L，四水硫酸锰0.03mg/L，硼酸0.3mg/L，六水氯化钴0.2mg/L，五水硫酸铜0.01mg/L，氯化镍六水合物0.02mg/L，钼酸钠0.03mg/L。
[0027]在一些方法的实例中，所述补料A的体积是步骤S1)中发酵基础培养基体积的8～15%。具体的添加量可以根据浓度和菌株的生长情况、PHA合成情况进行相应的调整。
[0028]在一些方法的实例中，所述补料B的体积是步骤S1)中发酵基础培养基体积的6本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产PHA的方法，包括：S1)以发酵基础培养基作为培养物，接种盐单胞菌液；S2)补料培养：当菌液中的含糖量降至10g/L后，依次补充补料A、补料B和补料C，控制糖浓度在5～15g/L；补料C补充完继续培养至菌液的残糖量降至不高于1g/L，放出部分菌液，从放出的部分菌液中提取PHA；S3)在剩余的菌液中加入发酵基础培养基，重复S2)进行重复批次发酵；其中：发酵基础培养基的组分主要为：葡萄糖340～560g/L，酵母粉2～5g/L，尿素30～50g/L，玉米浆干粉30～40g/L；补料A的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，尿素27.72～44.35g/L；补料B的组分主要为：葡萄糖 500～800g/L，硫酸铵5～8g/L；补料C的组分主要为：葡萄糖800g/L。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，盐单胞菌液的接种量与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4)中，剩余的菌液与发酵基础培养基的体积比为5：95至10：90。4.根据权利要求1所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：田道贺，沈宏伟，张恒文，孙磊，叶秀生，吕金艳，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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