一种R-3-羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法技术

本发明专利技术公开了一种R

【技术实现步骤摘要】
一种R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法。

技术介绍

[0002]3‑
羟基丁酸乙酯是合成许多手性药物的非常重要的手性医药中间体，3
‑
羟基丁酸乙酯分子中含有多功能基团，其手性单一对映异构体(R)
‑3‑
羟基丁酸乙酯和(S)
‑3‑
羟基丁酸乙酯均是非常有前景的重要的手性砌块。如(S)
‑3‑
羟基丁酸乙酯是薰衣草醇、核球壳菌、格哈菌素、卡包霉素和灰绿霉素前提等天然产物的手性源，(R)
‑3‑
羟基丁酸乙酯是合成亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、法罗培南、厄他培南、多尼培南、比阿培南等培南类抗生素和L
‑
肉碱重要手性中间体。
[0003]现有技术中，手性拆分法反应条件温和，效率高，但应用于工业化制备时成本较高；化学不对称合成法反应快速，但手性催化剂制备困难、价格昂贵；微生物不对称还原合成3
‑
羟基丁酸乙酯所得产物多为S型，R构型产物不易得到，且生物转化过程中底物浓度偏低也是生物催化不对称还原合成3
‑
羟基丁酸乙酯所需要解决的问题。现有技术中公开了一种手性医药中间体R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法，先发酵生成3
‑
羟基丁酸，然后再使用化学催化剂进行酯化反应，酯化反应是需要强酸/高温剧烈条件进行，只能在发酵结束后进行酯化，耗能，成本高，周期长，不易于提取精制，制备的3
‑
羟基丁酸乙酯也容易发生水解，且发酵过程需要灭菌，极大的浪费能源。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法。构建敲除聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因和过表达β
‑
酮硫解酶及乙酰乙酰辅酶A还原酶基因的工程菌。利用该工程菌进行发酵，在发酵过程中进行原位萃取。
[0005]本专利技术提供一种R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法，包括如下步骤：
[0006]S1：敲除Halomonas lutescens MDF
‑
9中的聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因(phaC)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，敲除后的聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因失去聚合生成聚3
‑
羟基丁酸的的功能，仍保留脱去辅酶A的功能，得到敲除菌株；
[0007]步骤S1中敲除phaC酶基因序列中表达为使得(R)
‑3‑
羟基丁酰辅酶A脱去辅酶A的3
‑
羟基丁酸聚合为聚3
‑
羟基丁酸的片段，仍保留催化(R)
‑3‑
羟基丁酰辅酶A脱去辅酶A的基因片段。phaC酶是聚3
‑
羟基丁酸酯生物合成过程中的关键酶，能够用羟基脂肪酸的辅酶A硫酯作为底物，催化3
‑
羟基丁酸脱去辅酶A聚合为聚3
‑
羟基丁酸酯聚合物。而敲除聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因片段，能使得在工程菌体内代谢产物为(R)
‑3‑
羟基丁酸单体，不再发生聚合反应生成聚合物。
[0008]S2：采用基因工程技术构建β
‑
酮硫解酶(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)的表达载体并导入S1得到的敲除菌株中，得到工
程菌；
[0009]将目的基因CDS序列克隆到细胞内的质粒上，使两者基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，产生足够的β
‑
酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶，使得胞内能实现(R)
‑3‑
羟基丁酸的生成两分子乙酰辅酶A，经β
‑
酮硫解酶生成(R)
‑3‑
羟基乙酰乙酰辅酶A，再经乙酰乙酰辅酶A还原酶生成(R)
‑3‑
羟基丁酰辅酶A。
[0010]将制得的工程菌株在以葡萄糖、果糖等六碳糖和乙醇为底物，细胞中引入外源及内源脂肪酶编码基因的表达并进行发酵，在脂肪酶的催化下，3
‑
羟基丁酸乙酰辅酶A与乙醇发生酯化反应，脂肪酶由胞体自带和外源加入两部分组成。
[0011]S3：将S2得到的工程菌进行发酵，在发酵过程中同时使用萃取剂进行原位萃取，使发酵得到的3
‑
羟基丁酸乙酯直接进入萃取相；有利于其后续的分离提取；
[0012]S4：提取产物。
[0013]进一步的，所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。
[0014]进一步的，所述步骤S4采用间歇共沸精馏法分离萃取剂和3
‑
羟基丁酸乙酯，得到最终产物3
‑
羟基丁酸乙酯。
[0015]进一步的，所述萃取剂为中长链烷烃。
[0016]进一步的，所述萃取剂为正十二烷、正十四烷、乙酸乙酯中的任意一种。
[0017]进一步的，所述步骤S3具体包括如下步骤：
[0018](1)平板种子培养：菌种活化；
[0019](2)摇瓶种子培养；
[0020](3)溶氧和pH电极校正；
[0021](4)发酵参数的设定；
[0022](5)接种；
[0023](6)发酵过程控制。
[0024]进一步的，所述步骤(4)中发酵罐温度控制在35
‑
40℃。
[0025]进一步的，所述步骤(4)中调节pH为7.5
‑
9.5。
[0026]进一步的，所述步骤(6)中控制溶氧为35
‑
80％。
[0027]进一步的，所述步骤(6)中控制发酵罐温度37
±
1℃，pH 8.5
±
1。
[0028]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0029](1)本专利技术的制备方法发酵和酯化同步进行，中间不经过生成3
‑
羟基丁酸步骤。
[0030](2)本专利技术的制备方法3
‑
羟基丁酸乙酯生产和萃取同步进行，可有效避免3
‑
羟基丁酸乙酯的水解。
[0031](3)本专利技术的制备方法使用嗜盐单胞菌Halomonas lutescens MDF
‑
9为底盘生物，发酵过程不需要灭菌，操作更加方便，可实现连续接种或补充底物进行不间断发酵，更加节省能源。
[0032](4)本专利技术的制备方法条件温和，能利用易获取的廉价底物快速繁殖、节能、环境友好，具有成本低，产量高，副产物少，易转化，周期短，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种R
‑3‑
羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：敲除Halomonas lutescens MDF
‑
9中的聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因，敲除后的聚3
‑
羟基丁酸酯聚合酶基因失去聚合生成聚3
‑
羟基丁酸的的功能，仍保留脱去辅酶A的功能，得到敲除菌株；S2：采用基因工程技术构建β
‑
酮硫解酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶的表达载体并导入S1得到的敲除菌株中，得到工程菌；S3：将S2得到的工程菌进行发酵，在发酵过程中同时使用萃取剂进行原位萃取，使发酵得到的3
‑
羟基丁酸乙酯直接进入萃取相；S4：提取产物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4采用间歇共沸精馏法分离萃取剂和3
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈宏伟，孙磊，张恒文，吕金艳，银会娟，何世琪，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：