用于合成高分子量共聚物的基因制造技术

本发明专利技术的目的在于提供红树林土壤宏基因组来源的聚合物合成酶基因以及使用该聚合物合成酶的有用共聚物的制备方法。另外，本发明专利技术的另一目的在于提供链霉菌属CFMR7来源的烯酰CoA水合酶基因以及通过该烯酰CoA水合酶的表达而3HHx的组成增加的有用共聚物P(3HB

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成高分子量共聚物的基因


本专利技术涉及红树林土壤宏基因组来源的聚合物合成酶编码基因以及链霉菌属CFMR7(保藏编号：CP011522)来源的烯酰CoA水合酶编码基因。更详细而言，本专利技术对分别编码聚合物合成酶和烯酰CoA水合酶的功能基因进行详细说明，两种功能基因一起使用时能够实现高分子量共聚物的合成。

技术介绍

聚羟基烷酸酯(PHAs)是在营养不足和压力条件下作为存储化合物(储备碳)由微生物(细菌和古细菌)生成的生物聚酯。与合成塑料相比，PHA的主要优点是具有与石油化学来源的塑料相同的物理化学的特性，此外还具有可生物降解性、生物相容性和可持续性。参与PHA聚合的重要酶是PHA合成酶(PhaC)。PhaC这种酶颇为神奇，它能够在细胞质的亲水性环境中使高分子量的疏水性PHA链聚合。目前关于PHA多样性的见解中，PHA生产者(producer)和PhaC主要是通过采用培养依存方式得到纯微生物分离物的相关研究而获得的。有报告称基于属的共计4种PhaC及167PHA生产者来自现有的可培养土壤微生物，这些现有的可培养土壤微生物占土壌微生物整体的15％以下。其余85％未进行过调研。因此，从该未调研的微生物群资源来看，在理解PHA生产者多样性方面存在巨大的见解偏差。红树林土壤生物群系统包含高度的微生物多样性持续面临生理盐水和无氧状态等各种非生物胁迫。一些研究中报告了从红树林环境中分离出PHA生产者。但是对于与红树林土壤宏基因组来源的PhaC相关的研究没有过报道。因此从红树林土壤宏基因组中的新微生物属、特别是难以在研究室中培养的厌氧微生物中发现大量新型PhaC的可能性很高。PHA的特性是通过控制二级单体的整合和/或组成从而能够适用于各种用途。细菌的PHA根据单体单元中的碳原子数主要分为短链长(scl)、中链长(mcl)以及scl
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mcl的组合这3种类型。scl
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PHA由3～5个碳原子构成，mcl
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PHA具有6～14个碳原子，而scl
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mcl
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PHA中每个单体的碳原子数可以在3～14个的范围内。生成的PHA的种类取决于聚合物合成酶的底物特异性。主要由scl单体构成的PHA通常硬且脆，而主要由mcl单体构成的PHA本质上具有弹性。Scl
‑
mcl PHA共聚物取决于共聚物中scl单体与mcl单体之比可具有两种状态之间的特性。由phaJ编码的烯酰CoA水合酶显示(R)特异性水合酶活性，具体而言，在生物合成中将(R)
‑3‑
羟基酰基
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CoA单体单元、例如由脂肪酸β氧化得到的3
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羟基己酸酯辅酶A(3HHx
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CoA)供给给聚(3
‑
羟基丁酸酯
‑
co
‑3‑
羟基己酸酯)[P(3HB
‑
co
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3HHx)]共聚物。作为与聚合物合成酶及其编码基因相关的现有技术，已报道有一些专利文献。专利文献1(美国专利第6，812，013号)涉及PHA的制备工艺中有用的PHA合成酶、该酶的编码基因、含有该基因的重组载体、利用该载体转化得到的转化子、利用该转化子进行的PHA合成酶的生成工艺以及利用该转化子进行的PHA的制备工艺。该专利技术的特征在于，向通过培养生成PHA合成酶或PHA的宿主微生物中导入Pseudomonas putida来源的PHA合成酶基因得到转
化子。另外，专利文献2(美国专利第2004
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146998号)涉及转化子以及使用该转化子制备聚合物的生成工艺。该专利技术公开了编码共聚物合成酶的基因、利用该基因得到的聚合物的发酵合成用微生物、以及基于微生物的聚合物生成方法。该专利技术着重于构筑含有聚酯合成相关酶基因、启动子和终止子并导入酵母的转化子。专利文献3(欧洲专利第1626087号)中公开了经改良的转化子以及使用该转化子的聚合物生成工艺。该专利技术公开了含有对Aeromonas caviae来源PHA合成酶进行编码的基因的基因表达盒。酵母也用作宿主，由于在启动子和终止子中导入了变异，因此基因盒能够在酵母内发挥作用。作为其他专利技术，公开有编码聚合物合成酶的基因与其他基因的组合。专利文献4(美国专利第2008
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233620号)公开了用于在酵母产生基因表达产物的转化子和工艺。转化子通过导入参与PHA合成的多个没基因、例如PHA合成酶与乙酰乙酰CoA还原酶基因的组合来获得。专利文献5(美国专利第2003
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146703号)中公开了表达PHA合成酶和细胞内PHA解聚酶两者的重组微生物。该专利技术能够实现PHA的同時合成和分解。专利文献6(美国专利第2012
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088280号)中公开了Chromobacterium属来源的新型聚合物合成酶、编码该酶的基因、含有该基因的重组载体、利用该载体转化得到的转化子、使用该转化子得到塑料聚合物的制备工序。几乎所有专利技术均涉及转化子以及使用已公开的转化子生成聚合物或PHA的工艺。但是这些专利技术包含来源于不同生物种的基因组的不同区域的PHA合成酶基因。目前尚不存在公开有从宏基因组DNA分离聚合物合成酶的专利技术。因此，本专利技术期望提供聚合物合成酶基因的改良DNA片段来生成重组载体和转化子。该转化子可用于对用于生成PHA的具有广泛底物特异性的聚合物合成酶赋予可适应多种用途的特性。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利第6,812,013号专利文献2：美国专利第2004
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146998号专利文献3：欧洲专利第1626087号专利文献4：美国专利第2008
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233620号专利文献5：美国专利第2003
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146703号专利文献6：美国专利第2012
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088280号

技术实现思路

专利技术要解决的问题本专利技术的主要目的在于提供红树林土壤宏基因组来源的聚合物合成酶基因、以及使用该聚合物合成酶制备有用共聚物的方法。本专利技术的另一目的在于提供链霉菌属CFMR7来源的烯酰CoA水合酶基因、以及通过该烯酰CoA水合酶的表达制备3HHx的组成增加的有用共聚物P(3HB
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co
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3HHx)的方法。本专利技术的另一目的在于开发通过使用含聚合物合成酶的转化子更高效地制备高分子量3HHx共聚物的方法。
本专利技术的另一目的在于开发通过使用含聚合物合成酶的转化子更高效地制备4HB和5HV等具有脂肪酶降解性单体序列的共聚物的方法。用于解决问题的手段本专利技术公开一种分离的多核苷酸，其编码多肽，该多肽含有序列编号(SEQ ID NO)1所记载的氨基酸序列或者1个以上的氨基酸经取代、缺失或插入的序列编号1所记载的氨基酸序列且具有聚合物合成酶活性。根据本专利技术的多核苷酸的一个实施方式，分离的多核苷酸含有序列编号2所记载的核苷酸序列、1个以上的核苷酸被取代的序列编号2所记载的核苷酸序列、或者其互补序列。根据本专利技术的多核苷酸的一个实施方式，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的多核苷酸，其编码多肽，所述多肽含有序列编号1所记载的氨基酸序列或者1个以上的氨基酸经取代、缺失或插入的序列编号1所记载的氨基酸序列，且具有聚合物合成酶活性。2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其含有序列编号2所记载的核苷酸序列、或者1个以上的核苷酸被取代的序列编号2所记载的核苷酸序列、或者其互补序列。3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中，序列编号2所记载的核苷酸序列中包含胸腺嘧啶被尿嘧啶取代的核苷酸序列或其互补序列。4.一种重组载体，其含有权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸。5.根据权利要求4所述的重组载体，其为质粒或噬菌体。6.一种转化子，其是使用权利要求4所述的重组载体进行转化而得到的。7.一种聚合物的制备方法，其包括：在含聚合性材料的培养基中培养权利要求6所述的转化子的工序；以及从经过所述培养的培养基中回收聚合物的工序。8.一种重组株，其基因组中具有权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸。9.一种聚合物的制备方法，其包括：在含聚合性材料的培养基中培养权利要求8所述的重组株的工序；以及从经过所述培养的培养基中回收聚合物的工序。10.根据权利要求7或9所述的聚合物的制备方法，其中，所述聚合物为聚羟基烷酸酯。11.一种分离的多核苷酸，其编码多肽，所述多肽含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：井上浩三，苏得什，
申请(专利权)人：株式会社未来科学，
类型：发明
国别省市：