一种经肝动脉肝内移植胰岛细胞的移植方法技术

一种经肝动脉肝内移植胰岛细胞的移植方法，采用Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒ技术，经股动脉穿刺，插入导管至右肝动脉，经造影证实后，经导管缓慢注入分离、纯化、培养后的新生猪胰岛细胞４－８×１０＃＋［６］个。是一种有利于植入胰岛细胞的存活，创伤小，可安全、有效地发挥其胰岛细胞生理功能的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过介入放射技术肝内移植胰岛细胞的移植方法。
技术介绍
由于I型糖尿病在注射外源性胰岛素的情况下，对血糖的控制是不精确的，往往不可避免地导致各种并发症的产生。而胰岛细胞移植被认为是最终治疗。胰岛移植不仅能纠正糖尿病患者的糖代谢异常，更重要的是可以防止糖尿病微血管病变的发生发展。但目前，植入胰岛细胞较多的移植方式有腹腔、肾被膜下、骨骼肌、脾脏移植等。但这些移植的方式及部位并不是糖和胰岛素动力学弥散的最有效的方式，且移植部位均不能达到理想的效果。目前的研究认为，肝内植入胰岛细胞比较拟合生理状态。而骨骼肌以及肾被膜下等移植的方法及部位对糖尿病控制的效果不是很好。但经门静脉移植可产生门静脉高压、肝梗死和肝功能衰竭等并发症。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种有利于植入胰岛细胞的存活，创伤小，可安全、有效地发挥其胰岛细胞生理功能的经肝动脉肝内移植胰岛细胞的移植方法。本专利技术的技术方案为采用Seldinger技术，经股动脉穿刺，插入导管至右肝动脉，经造影证实后，经导管缓慢注入分离、纯化、培养后的新生猪胰岛细胞4-8×106个。由于肝脏为肝动脉和门静脉两路供血(以门静脉为主)通过肝动脉植入胰岛细胞不会明显影响肝脏功能和血流动力学特点。而植入的胰岛细胞团停留在血运丰富的肝组织内，有利于植入的胰岛存活。植入胰岛细胞随血流进入肝窦或窦前肝血管内，而减少植入移植体周围形成纤维瘢的可能，有利于植入细胞团的存活和功能的发挥。本专利技术具用创伤小，安全的特点。具体实施例方式I型糖尿病病人4例，其中男3例，女1例，年龄分别为6、31、36、40岁。检查4例病人移植前空腹血糖为12-15mmol/L，餐后血糖为21-33mmol/L，均多次发生酮症及酸中毒；外源性胰岛素每日用量分别为30U、25U、43U、48U。4例病人经神经系统、眼底检查及B超、心电图等检查未发现晶体、视网膜、心血管、神经系统和心、肝、肾功能异常。移植前后，用免疫组织化学法测定病人的CD4/CD8比值，监测有无发生免疫排斥反应。猪胰岛细胞的分离、纯化和培养出生2-5天的新生猪(冠-尾20-22cm)戊巴比妥钠麻醉后，无菌状态下剖腹取胰，去除肉眼所见的胰外组织、导管及结缔组织后，将胰腺剪成0.5-1.0mm3大小组织碎块；用0.5mg/ml浓度的V型胶原酶(collagenaseV，Sigma公司提供)充分消化；用4C无Ca2+、Mg2+平衡盐缓冲液(D-Hank液)中止消化，加入含20％小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、1％谷氨酰氨的合成培养基(增补RPMI1640液)于37C、5％CO2和95％空气孵箱内培养。第2天换培养液1次，以后隔1天换1次培养液，第5天做胰岛细胞胰岛素释放试验，第7-10天收集胰岛细胞在倒置显微镜及电镜下观察细胞形态，用平板计数计算胰岛细胞团的收获量，镜检以胰岛细胞与其他细胞之比来测量细胞纯度。在移植前30分钟，将培养瓶内贴壁生长的胰岛细胞用0.1％胰蛋白酶消化、冲洗后，制成细胞混悬液备用。移植方法用Seldinger技术经右股动脉插入导管至右肝动脉，造影证实后，经导管缓慢注入纯化后的猪胰岛细胞。例1、例2分别为4×106个，例3、例4为8×108个。抗排斥方案甲泼尼龙首次剂量500mg，第2天减至50mg；3天后减为服用泼尼松30mg/d，逐渐减量至10mg/d，1个月后停用泼尼松。环孢素初始剂量为每天8mg/kg，每天2次，维持该剂量2周，谷值在于250-400ng/ml之间，以后根据血药浓度将药物用量逐渐减至每天2-5mg/kg，用药时间为1年。霉酚酸酯每天2g，每日2次，共用25天。阿昔洛韦移植后用，400mg/次，每日2次，共服用14天。实验室检查移植前后进行肝功能检查，King法测定丙氨酸转氨酶(ALT)。结果1、胰岛细胞体外检查结果培养、纯化后的猪胰岛细胞用双硫腙法染色，纯度为80％以上。体外葡萄糖刺激试验和茶碱刺激试验均说明胰岛细胞具有正常的生理功能。2、移植后胰岛素使用剂量移植胰岛细胞以后，由于使用甲泼尼龙，病人胰岛素用量一次性增高，随着甲泼尼龙的减量和停用，胰岛素用量明显减少，外源性胰岛素用量下降幅度为32％-58％，其下降幅度与移植的胰岛细胞数量有关，在植入细胞数量为4×106个的2个病例，外源性胰岛素下降幅度为32％和36％；在植入8×108个病例中，胰岛素下降幅度为50％和58％。3、血糖在使用外源性胰岛素情况下，移植前后血糖维持在4-7mmol/L之间，血糖其本维持正常水平。4、糖化血红蛋白例1移植前为GHb为9％，例2为7％，例3为11％，例4为12％，移植后3个月后复查，GHb为4-6％，下降至正常范围。5、肝功能检查结果显示移植前后ALT均在正常范围。6、移植前后病人CD4/CD8维持在1.10-1.22。7、移植以后，4例病人均未发生过酮症、酸中毒，外源性胰岛素用量维持在较低的水平，生活质量较前明显提高。权利要求，采用Seldinger技术，经股动脉穿刺，插入导管至右肝动脉，经造影证实后，经导管缓慢注入分离、纯化、培养后的新生猪胰岛细胞4-8×106个。全文摘要，采用Seldinger技术，经股动脉穿刺，插入导管至右肝动脉，经造影证实后，经导管缓慢注入分离、纯化、培养后的新生猪胰岛细胞4－8×10文档编号A61B17/00GK1473549SQ0211432公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月7日 优先权日2002年8月7日专利技术者王维, 刘晟, 罗贤明, 莫朝晖, 叶斌, 王 维 申请人:长沙惠霖干细胞工程有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经肝动脉肝内移植胰岛细胞的移植方法，采用Ｓｅｌｄｉｎｇｅｒ技术，经股动脉穿刺，插入导管至右肝动脉，经造影证实后，经导管缓慢注入分离、纯化、培养后的新生猪胰岛细胞４－８×１０↑［６］个。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王维，刘晟，罗贤明，莫朝晖，叶斌，
申请(专利权)人：长沙惠霖干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]