一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法技术

本发明专利技术为一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法，涉及一种用于鉴定多种病毒与人类基因组整合的扩增子文库测序方法，首先使用Tn5转座酶进行基因组DNA的片段化，磁珠纯化保留150bp以上的片段化DNA作为模板，病毒特异性扩增引物库和P7端接头进行扩增后纯化得到前期文库，再通过一轮PCR扩增为前期文库加上P5端接头，然后磁珠纯化得到测序文库，最后在华大智造MGISEQ

【技术实现步骤摘要】
一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法。

技术介绍

[0002]致瘤性DNA病毒一直以来在恶性肿瘤病因发病学方面一直扮演着重要角色。目前有50多种致瘤性DNA病毒可以引起人类和动物肿瘤。己经明确是人类恶性肿瘤发生发展的关键因子的DNA致瘤病毒包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein
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Barr virus，EBV)，和卡波济肉瘤相关疱瘆病毒(Kaposi
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ssarcoma
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associated herpesvirus，KSHV)等。
[0003]尽管致瘤病毒与人类恶性肿瘤的病因学关系仍未完全阐明，但有大量研究证实，这些致瘤性病毒可以感染进入宿主细胞后编码病毒蛋白，病毒蛋白可通过激活原瘤基因表达、调节细胞周期蛋白，抑制细胞调亡等方式促进肿瘤形成。而同时亦有资料表明，致瘤性DNA病毒普遍还具有另外一种重要手段导致细胞癌变，那就是致瘤性DNA病毒在宿主细胞基因组上的整合。致瘤性DNA病毒在宿主细胞基因组上的整合是致瘤性DNA病毒长时期进化形成的一种重要的保存自我、同时维持在宿主细胞内长期稳定的感染并进攻宿主细胞基因组引起细胞癌变的经典手段。致瘤性DNA病毒整合的致瘤性表现在多个方面。致瘤病毒整合进入宿主基因组能够引起宿主细胞基因组不稳定，导致染色体的倒位易位缺失以及重排，从而使得宿主细胞基因组结构出现异常；同时能够引起插入诱变导致宿主关键抑瘤基因异常失活或瘤基因异常激活，病毒整合也能够引起基因组的某些基因拷贝数变异，间接影响某些基因的表达水平。
[0004]近年来在测序技术上的巨大进步为我们在病毒整合方向的研究提供了契机。我国妇产科学家马丁教授团队采用全基因组测序和高通量病毒整合检测，在26个宫颈上皮内瘤变
[0005](cervical intraepithelial neoplasia，CIN)样本、104个宫颈癌样本和5个宫颈癌细胞系中鉴别出了3667个HPV DNA整合位点。他们发现当HPV DNA整合到FHIT和LRP1B基因的内含子中时，它们的蛋白表达下调。而当HPV DNA整合到MYC和HMGA2基因的侧翼区时，这些基因的蛋白表达升高。paterlini等人从肝癌细胞中鉴定出了9个DNA整合区域，利用HBV
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ALU PCR的方法说明病毒基因在宿主基因的整合能够导致具有重要的调节作用的基因产生突变，这些基因在细胞增殖与分化和生存中均起着重要作用。已有报道证实EBV可整合至细胞染色体引起染色体异常、并影响一些癌基因或抑癌基因的表达比如EBV整合在NAB
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2细胞基因组的癌基因REL附近并引起REL表达上调等。另外，Lestou等发现，在淋巴瘤细胞系里面是一种非随机的整合。
[0006]目前病毒整合相关检测方法相对较多，但是技术操作繁琐，稳定性差，检测结果不准确，不全面，找到最佳检测方法亦是目前亟需解决的问题。本专利技术阐述了一种检测病毒整合的新方法，利用Tn5酶打断DNA建库进行二代测序，并以宫颈癌为例，揭示与宫颈癌发生相
关的整合位点，具有检测方法灵敏，检测结果全面等优点。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的新方法。本方法开创性地在Tn5转座酶打断DNA后，采用病毒特异性的引物库，基于多重PCR反应进行建库，可以简单快捷地检测样本，降低成本，便于病毒整合检测的大规模应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术包括如下步骤：
[0009](1)选取病毒感染部位细胞样本，采用商业化的试剂盒进行DNA提取；
[0010](2)将Tn5转座酶与单链Adapter1、Adapter2及ME退火
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包埋形成Tn5转座体；
[0011](3)将步骤(1)得到的DNA使用步骤(2)的Tn5转座体使DNA片段化；
[0012](4)将步骤(3)得到的片段化DNA使用病毒特异性扩增引物库与P7端的接头进行文库富集，扩增产物纯化得到前期文库；病毒特异性扩增引物库中每条引物浓度与P7端接头浓度比为3：1；
[0013](5)将步骤(4)得到的前期文库与P5端接头扩增进行补齐，得到含P5及P7端完整接头的PCR产物，纯化得到平均片段大小为320bp的测序文库；
[0014](6)测序文库进行二代测序。
[0015]优选的，步骤(2)中，使用诺唯赞Tn5转座酶进行转座体构建，首先单链Adapter1、Adapter2分别与单链ME等浓度(200μM)等体积(10μL)混合退火，退火后体积1：1混合形成Adapter Mix，然后进行包埋，包埋体系为：Tn5转座酶10μL(1U/μL)，Adapter Mix 4μL，10*TPS缓冲液2μL，Nuclease
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free水4μL，包埋条件为30℃反应1小时；
[0016]优选的，步骤(3)中，DNA片段化的体系包括：5*TAPS、MgCl2、Tn5转座体；DNA使用Tn5转座酶片段化体系为：基因组DNA30
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50ng，5*TAPs 4μL，25mM MgCl
2 4μL，Tn5转座酶1μL，Nuclease
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free水补足20μL，片段化条件为55℃处理10min，然后Beckman AMPure XP磁珠1*纯化一次。
[0017]优选的，步骤(4)中，文库富集的引物包括病毒特异性扩增引物库及P7端接头，其中病毒特异性扩增引物库中的引物以整个病毒序列为参考序列，全覆盖设计并在5'端加上Adapter1序列；文库富集体系为：片段化产物12.5μL，PCR 10*Buffer 5μL，dNTPs 1μL，病毒特异性扩增引物库30μL(2μM)，P7端含Barcode的接头1μL(20μM)，Taq HS 0.5μL(5U/μL)。富集条件为：72℃3min，98℃30sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃3min，40个循环；72℃5min。然后Beckman AMPure XP磁珠纯化，纯化步骤为：50μL扩增产物中加入20μL磁珠进行一轮纯化，收集上清液继续加入25μL磁珠进行二轮纯化，弃上清，80％乙醇漂洗三次，晾干，30μL DNA洗脱液洗脱后继续加入24μL磁珠纯化，弃上清，80％乙醇漂洗三次，晾干，30μL DNA洗脱液洗脱得到前期文库。
[0018]优选的，步骤(5)中，P5端接头补齐体系为：4*TSP Master Mix 7.5μL，P5端接头6μL(2μM)，前期文库4.5μL，Nuclease
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free水12μL。接头补齐条件为：95℃15min；95℃15sec，60℃90sec本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取病毒感染部位细胞样本进行DNA提取，得到质量合格的DNA；(2)将Tn5转座酶与单链Adapter1、Adapter2及ME退火
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包埋形成Tn5转座体；(3)将步骤(1)得到的DNA使用步骤(2)的Tn5转座体使DNA片段化；(4)将步骤(3)得到的片段化DNA使用病毒特异性扩增引物库与P7端接头进行文库富集，扩增产物纯化得到前期文库；(5)将步骤(4)得到的前期文库与P5接头扩增，得到含P5及P7端完整接头的PCR产物，纯化得到平均片段大小为320bp的测序文库；(6)测序文库进行二代测序。2.根据权利要求1所述的一种采用Tn5转座酶辅助建库检测病毒整合的方法，其特征在于，步骤(3)中，DNA片段化的体系包括：5*TAPS、MgCl2、Tn5转座体。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：董辉，曾晓，贺成虎，周宏骏，金维荣，秦红友，
申请(专利权)人：申友基因组研究院南京有限公司，
类型：发明
国别省市：