一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法制造技术

本发明专利技术涉及一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，血浆经甲酸甲醇和乙酸乙酯萃取血浆中游离氨基酸并氮气吹干，吹干样品复溶后经超高效反相色谱将氨基酸分离和串联质谱的多反应模式监测；本发明专利技术建立了一种超高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法


[0001]本专利技术属于血清检测领域，主要涉及串联质谱法检测人体血浆中9种游离氨基酸的技术，具有检测时间短、检测灵敏度高的特点。

技术介绍

[0002]游离氨基酸是以游离状态在生物体内存在的一组氨基酸，是既含氨基(－NH2)又含羧基(
‑
COOH)的有机化合物。所测的九种氨基酸，根据R基的性质分为：1)含非极性、疏水性R基的氨基酸：缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甘氨酸(Gly)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)；2)含极性、中性R基的氨基酸：谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)；3)含酸性R基的氨基酸：谷氨酸(Glu)。
[0003]目前，有关游离氨酸的检测方法有很多，如氨基酸分析仪测定法、液相色谱
‑
串联质谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等方法。氨基酸分析仪测定法适用于测定蛋白质、多肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量，而液相色谱
‑
串联质谱法(LC
‑
MS/MS)能够区分氨基酸及其代谢产物，灵敏度高，特异性强，适用于血浆或血清中多种游离氨基酸的检测。但是，目前的LC
‑
MS/MS技术检测游离氨基酸仍然存在问题，如样本用量大、需要柱前衍生化、前处理方法复杂、检测时间长、且运用多种氨基酸内标定量等。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术中存在的不足，本专利技术采用一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，所采用的方法具有样本用量少、前处理简便、一种内标即可准确定量、检测时间短、检测灵敏度高等优点。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]超高效液相色谱
‑
串联质谱法检测血浆中的9种游离氨基酸，其中所述氨基酸为：甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸；
[0007](1)氨基酸标准品溶液配制为：
[0008]精确称取每种氨基酸标准品10mg，根据物质溶解性不同，酪氨酸用0.1mol/L稀盐酸水溶液配制成浓度为10mg/mL标准品母液，谷氨酸用纯甲醇溶液配制成浓度为10mg/mL标准品母液，其余7种氨基酸用过滤的超纯水配制即可，再从氨基酸标准品母液各取适量体积用50％(V/V)甲醇水配制得到相应浓度的氨基酸标准品工作液，并稀释成不同的校准曲线工作浓度范围；
[0009]甘氨酸标准品工作液浓度为150μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为100ng/mL～75μg/mL；
[0010]谷氨酰胺标准品工作液浓度为25μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～12.5μg/mL；
[0011]谷氨酸标准品工作液浓度为100μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为50ng/mL～50μg/mL；
[0012]缬氨酸标准品工作液浓度为100μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～50μg/mL；
[0013]酪氨酸标准品工作液浓度为50μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～25μg/mL；
[0014]异亮氨酸标准品工作液浓度为200μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为100ng/mL～100μg/mL；
[0015]亮氨酸标准品工作液浓度为50μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～25μg/mL；
[0016]苯丙氨酸标准品工作液浓度为25μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～12.5μg/mL；
[0017]色氨酸标准品工作液浓度为150μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为50ng/mL～75μg/mL；
[0018]各氨基酸标准品工作液，按照校准曲线工作浓度范围稀释为6
‑
10个浓度梯度；
[0019](2)内标标准品溶液配制为：
[0020]精确称取内标标准品10mg，并加入纯甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/mL内标标准品母液，再将内标标准品溶液用纯甲醇稀释成浓度为10μg/mL的内标标准品工作液；
[0021]内标为2
‑
氯
‑
苯丙氨酸；
[0022](3)样品前处理方法为：
[0023]在样本前处理前，先将血浆样本用生理盐水稀释15倍，再从稀释的样本中吸取10μL，加入10μL浓度为10μg/mL的内标溶液，再加入20μL的含0.1％(V/V)甲酸的甲醇溶液和40μL乙酸乙酯溶液，混匀振荡60～120s，于
‑
20℃静置10～15min后在4℃低温下16000rpm离心10～15min，取60μL上清液氮吹，加入200μL流动相A溶液复溶，混匀振荡60～120s，超声10～20s，在低温条件下以16000rpm离心10～15min，取80μL上清液用于超高效液相色谱
‑
串联质谱检测；
[0024](4)上述方法中，超高效液相色谱的色谱条件为：
[0025]色谱柱：ACE 3 C18
‑
PFP，100
×
2.1mm id，3μm；
[0026]流动相A：含0.5％(V/V)乙酸、0.025％(V/V)甲酸、0.05％(V/V)七氟丁酸的水溶液；
[0027]流动相B：纯甲醇溶液；
[0028]柱温箱：35℃；
[0029]进样箱：6℃；
[0030]流速：0.4mL/min；
[0031]进样体积：2μL；
[0032]洗针液：50％(V/V)甲醇水溶液；
[0033]洗脱方式：梯度洗脱；
[0034]洗脱程序为：
[0035][0036](5)上述方法中，串联质谱检测条件为：
[0037]离子源：电喷雾离子源ESI源；
[0038]极性模式：正离子模式；
[0039]监测模式：多反应监测模式MRM；
[0040]雾化帘气压CUR：35psi；
[0041]离子化电压IS：5500V；
[0042]碰撞室强度CAD：Medium；
[0043]雾化温度TEM：550℃；
[0044]辅助气压GS1：55psi；
[0045]辅助气压GS2：55psi；
[0046]由于采用了以上技术，本专利技术较现有技术相比，具有的有益效果如下：
[0047]本专利技术建立了一种超高效液相色谱
‑
串联质谱检测血浆中的9种游离氨基酸的方法，通过一种内标即可定量测定，减少了方法运行的成本；样品前处理方法能够较好地去除血浆中蛋白质等物质干扰，从而提高检测灵敏度，缩短检测分析时间；
[0048]本专利技术采用MRM模式监测母离子Q1和子离子Q3的质谱信号，以Q1/Q3的离子对的色谱峰面积比和浓度比进行定量分析，同时校准曲线线性相关系数均大于0.99，为血液中游离氨基酸提供了一种可靠的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，其特征在于，步骤如下：(1)氨基酸标准品溶液配制：(2)内标标准品溶液配制：称取内标标准品10mg，加入甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/mL内标标准品母液，再加入甲醇溶液稀释成浓度为10μg/mL的内标标准品工作液；(3)样品前处理方法为：取血浆样本，并用生理盐水稀释15倍，再从稀释的样本中吸取10μL；加入10μL内标标准品工作液，再加入甲酸甲醇/乙酸乙酯混合溶液，振荡后静置、离心；取60μL上清液氮吹，再用200μL流动相A溶液复溶，振荡后超声、离心，取80μL上清液进行超高效液相色谱
‑
串联质谱检测。2.根据权利要求1所述的一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，其特征在于：步骤(2)中内标为2
‑
氯
‑
苯丙氨酸。3.根据权利要求1所述的一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，其特征在于：步骤(3)中，甲酸甲醇/乙酸乙酯混合溶液为含0.1％(V/V)的甲酸的甲醇溶液20μL和乙酸乙酯溶液40μL。4.根据权利要求1所述的一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，其特征在于：步骤(3)中，振荡后静置、离心的步骤如下：混匀振荡60～120s，于
‑
20℃静置10～15min后，以16000rpm离心10～15min。5.根据权利要求1所述的一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法，其特征在于：步骤(3)中，振荡后超声、离心的步骤如下：混匀振荡60～120s，超声10～20s后，以16000rpm离心10～15min。6.根据权利要求1所述的一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法...

【专利技术属性】
技术研发人员：金维荣，董辉，周蓉，秦红友，李雯，
申请(专利权)人：申友基因组研究院南京有限公司，
类型：发明
国别省市：