用于检测苜蓿花叶病毒的引物及探针、试剂盒和应用制造技术

用于检测苜蓿花叶病毒的引物及探针、试剂盒和应用，它涉及检测领域。本发明专利技术要解决目前无法获取苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AMV)三分体基因组(RNA 1、RNA 2、RNA 3)在虫体内以及马铃薯上的含量，有针对性的进行检测的问题。本发明专利技术建立了AMVEvaGreen染料法RT

【技术实现步骤摘要】
enzyme
‑
linked immunosorbent assay,DAS
‑
ELISA)(Hajimorad&Francki，1988；He et al.,2011)、核酸斑点杂交法(Nucleic acid dot hybridization)(Alhudaib，2018)、逆转录—聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT
‑
PCR)检测AMV RNA 3(Xu&Nie，2006)及三重RT
‑
PCR法检测AMV RNA 2、PVY、PLRV等(Abdel Aleem et al.，2018)。其中，ELISA和核酸斑点杂交法适合大批量样品检测，RT
‑
PCR法灵敏度较高适合检测病毒浓度较低的样品(Alhudaib，2018)。实时荧光PCR技术自发展以来，由于其灵敏、准确、快速等特点，已广泛应用于感染人类、动物(黄小武等，2020)和植物的微生物检测工作中，包括病毒(王瑛丽等，2019)、类病毒(郗娜娜等，2020)、细菌(卢美欢等，2019)、真菌(雷翠云等，2019)、植原体(王柱华等，2020)和线虫(宋志强等，2013)等，也可用于检测介体蚜虫体内的植物病毒(刘永清等，2010；韩树鑫等，2016)。目前应用比较广的是Taq Man探针和SYBR Green或EvaGreen染料法，染料法RT
‑
qPCR检测柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)(宋震等，2017)，qPCR检测番茄煤污假尾孢叶斑病菌(康华军等，2019)时灵敏度分别是普通PCR的100倍和1000倍。
[0005]AMV、马铃薯奥古巴花叶病毒(potato aucuba mosaic virus，PAMV)和马铃薯帚顶病毒(potato mop
‑
top virus，PMTV)侵染马铃薯均可引起叶片黄斑花叶症状，而且AMV引起的植株症状会随气温升高而减轻乃至消失，当气候条件适合时症状再次出现(Gibbs&Tinsley,1961)，此外，应用ELISA法检测大豆AMV发生情况时发现检测结果与植株症状关系不大(He et al.,2011)。因此，不易依据马铃薯症状目测AMV发生情况，准确、灵敏、快速的分子检测技术对于检测马铃薯核心种苗、各级种薯中AMV是非常需要的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决目前无法获取并确定苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AMV)三分体基因组(RNA 1、RNA 2、RNA 3)在虫体内以及马铃薯上的含量，有针对性的进行检测的问题，而提供用于检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物和TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针、试剂盒和应用。
[0007]本专利技术的用于检测苜蓿花叶病毒的引物、探针，所述的引物、探针为RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针；所述的RT
‑
PCR引物为：
[0008]1‑
970F：CGAATCGAACGTAAGCAA；
[0009]1‑
1290R：ATGATTCGTTGAAGAAGATAA；
[0010]2‑
812F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；
[0011]2‑
1054R：TCAGATCGATTCGACATGGA；
[0012]3‑
1749F：TACCGATTCAACGAAGTTT；
[0013]3‑
1957R：TATCAGGAGCGAATAGGACT；
[0014]所述的EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物为：
[0015]1‑
970F：CGAATCGAACGTAAGCAA；
[0016]1‑
1290R：ATGATTCGTTGAAGAAGATAA；
[0017]2‑
812F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；
[0018]2‑
1054R：TCAGATCGATTCGACATGGA；
[0019]3‑
1522F：GTCTCACTGATGACGTGACG；
[0020]3‑
1629R：CAAACCCGAACTTCTCATT；
[0021]所述的TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针为：
[0022]1‑
970F：CGAATCGAACGTAAGCAA；
[0023]1‑
1102R：CCATTTGTCCTTTGACTCTATT；
[0024]探针P1：5`CY5
‑
TTTGTCCCCAAGATGCCACAYTCC
‑
3`
[0025]2‑
812F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；
[0026]2‑
1006R：CAACCCATTCTTGAAAATACTT；
[0027]探针P2：5`HEX
‑
TCAGGTAATGATTGGATGACGTTGG
‑
3`；
[0028]3‑
1749F F：TACCGATTCAACGAAGTTT
[0029]3‑
1957R：TATCAGGAGCGAATAGGACT；
[0030]探针P3：5`6
‑
FAM
‑
AGCAGGGCCCCTCCGCAG
‑
3`。
[0031]利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针检测蓟马和/或蚜虫体内的苜蓿花叶病毒。
[0032]进一步地，利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针检测蚜虫体内的苜蓿花叶病毒的RNA 1和RNA 2。
[0033]进一步地，利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针检测蓟马体内的苜蓿花叶病毒的RNA 1。
[0034]进一步地，利用所述的检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测苜蓿花叶病毒的引物、探针，其特征在于所述的引物、探针为RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针；所述的RT
‑
PCR引物为：1
‑
970 F：CGAATCGAACGTAAGCAA；1
‑
1290 R：ATGATTCGTTGAAGAAGATAA；2
‑
812 F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；2
‑
1054 R：TCAGATCGATTCGACATGGA；3
‑
1749 F：TACCGATTCAACGAAGTTT；3
‑
1957 R：TATCAGGAGCGAATAGGACT；所述的EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物为：1
‑
970 F：CGAATCGAACGTAAGCAA；1
‑
1290 R：ATGATTCGTTGAAGAAGATAA；2
‑
812 F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；2
‑
1054 R：TCAGATCGATTCGACATGGA；3
‑
1522F：GTCTCACTGATGACGTGACG；3
‑
1629R：CAAACCCGAACTTCTCATT；所述的TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针为：1
‑
970 F：CGAATCGAACGTAAGCAA；1
‑
1102 R：CCATTTGTCCTTTGACTCTATT；探针P1：5`CY5
‑
TTTGTCCCCAAGATGCCACAYTCC
‑
3`2
‑
812 F：ATGAAGCCGTCATATCAGGT；2
‑
1006 R：CAACCCATTCTTGAAAATACTT；探针P2：5`HEX
‑
TCAGGTAATGATTGGATGACGTTGG
‑
3`；3
‑
1749 F F：TACCGATTCAACGAAGTTT3
‑
1957 R：TATCAGGAGCGAATAGGACT；探针P3：5`6
‑
FAM
‑
AGCAGGGCCCCTCCGCAG
‑
3`。2.如权利要求1所述的用于检测苜蓿花叶病毒的引物、探针的应用，其特征在于利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针检测蓟马和/或蚜虫体内的苜蓿花叶病毒。3.根据权利要求2所述的用于检测苜蓿花叶病毒的引物、探针的应用，其特征在于利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引物及探针检测蚜虫体内的苜蓿花叶病毒的RNA 1和RNA 2。4.根据权利要求2所述的用于检测苜蓿花叶病毒的引物、探针的应用，其特征在于利用所述的检测苜蓿花叶病毒的RT
‑
PCR引物、EvaGreen染料法RT
‑
qPCR引物或TaqMan探针法RT
‑
qPCR引...

【专利技术属性】
技术研发人员：高艳玲，范国权，白艳菊，张威，张抒，程胜群，孙旭红，申宇，马纪，邱彩玲，刘凯，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：