一种AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法技术

本发明专利技术属于基因治疗领域，涉及一种AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法。通过本发明专利技术的优化提供一种灵敏度高、特异性好并且准确可靠的AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法，用于基因治疗产品临床前生物分布研究。于基因治疗产品临床前生物分布研究。

【技术实现步骤摘要】
一种AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法


[0001]本专利技术属于基因治疗领域，涉及一种AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法。

技术介绍

[0002]年龄相关性黄斑变性（AMD）又称老年性黄斑变性，是一种导致老年人严重视力减退甚至失明的眼病，其发病与年龄、环境、遗传、氧化应激、脂质代谢、免疫机制等多因素相关。湿性AMD以黄斑区新生血管为主要病理特征，血管内皮生长因子（VEGF）已被证实是导致湿性AMD的重要因子。因此，抗 VEGF药物是湿性AMD治疗领域中里程碑性的进展。
[0003]目前临床上使用的抗VEGF药物包括两大类：单克隆抗体类和融合蛋白类。2019年 10月之前，单克隆抗体类药物主要包括一代药物贝伐单抗和二代药物雷珠单抗，它们均可与所有VEGF
‑
A结合。另一种单克隆抗体类药物Brolucizumab是一种人源单链抗体片段，是由诺华制药研发的新型抗VEGF药物，于 2019年 10月由FDA批准用于湿性AMD的治疗。融合蛋白类药物主要包括阿柏西普和康柏西普，均为基因重组的可溶性VEGFR融合蛋白，能结合VEGF
‑
A、VEGF
‑
B以及PIGF。药代动力学研究表明，与单克隆抗体类相比，阿柏西普与VEGF
‑
A结合的亲和力更高，半衰期更长。
[0004]但是抗VEGF治疗的抗体类药物和融合蛋白类药物也带来了诸多挑战和难题，如患者需要多次玻璃体内注射。通过腺相关病毒载体携带抗VEGF的融合蛋白基因，进行玻璃体内注射或视网膜下注射，可使抗VEGF的融合蛋白在视网膜长期高表达，从而达到抑制新生血管的作用。RGX314是美国Regenxbio公司使用一种新的AAV8载体通过玻璃体切割和视网膜下腔注射的方式递送一种诱导产生抗VEGF Fab（类似于雷珠单抗）的基因，目前此药物已经进入Ⅲ期临床。ADVM022是Adverum公司研发的一种编码阿柏西普的经优化后的腺相关病毒载体的药物，主要通过玻璃体内注射传递目的基因和高水平表达治疗蛋白，目前此药物已经进入Ⅱ期临床。
[0005]基因治疗的生物分布是非临床研究的关键部分，是指受试物在相关动物种属中给药部位、靶组织和非靶组织包括体液（例如血液、脑脊液、玻璃体液）在内的体内分布、存续和清除，有助于解释药理学、毒理学的研究发现，也为临床试验设计提供支持信息。许多指导文件建议使用定量聚合酶链反应(qPCR)和/或定量逆转录酶PCR (qRT
‑
PCR)分析，然而开发一种灵敏度高、特异性好并且性能稳定的AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法仍然存在许多挑战。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过优化的组织基因组DNA提取方法，通过向空白动物组织中spike in已知滴度的目的基因AAV病毒，然后提取组织基因组DNA，通过SYBR Green qPCR的方法定量检测回收到的目的基因AAV病毒基因组，计算回收率。
[0007]本专利技术优化地使用了不同的TaqMan probe Mix，比较了不同的扩增体系对TaqMan qPCR扩增的影响。优选地使用了TaqMan
®
Fast Advanced Master Mix(Thermo)扩增体系，
TaqMan Universal PCR Master Mix体系(Thermo)和AceQ qPCR Probe Master Mix体系(诺唯赞)进行了不同浓度引物和探针的测试；有些方案采用900nM引物，又有些方案采用600nM引物，又有些方案采用400nM引物，又有些方案采用200nM引物；有些方案采用300nM探针，又有些方案采用200nM探针，又有些方案采用100nM探针；更优选地，引物浓度为200nM；更优选地，探针浓度为100nM。
[0008]本专利技术优化地使用了将梯度浓度的质粒标准品spike in到动物肝脏gDNA样品中，优选地使用了TaqMan
®
Fast Advanced Master Mix，TaqMan Universal PCR Master Mix和AceQ qPCR Probe Master Mix体系对设计的针对递送的目的基因序列的探针和引物进行扩增灵敏度和特异性验证。
[0009]本专利技术优化地使用了将梯度浓度的质粒标准品spike in到动物肝脏gDNA样品中，优选地使用了AceQ qPCR Probe Master Mix体系对设计的针对递送的目的基因序列的探针和引物的扩增灵敏度、特异性、准确性及基质效应进行了验证。
[0010]有益效果：通过本项目的优化能够开发一种灵敏度高、特异性好并且准确可靠的AMD基因治疗AAV生物分布qPCR检测方法，用于基因治疗产品临床前生物分布研究。
[0011]附图说明：图1 基因组DNA提取优化前AAV基因组回收率；图2 基因组DNA提取优化后AAV基因组回收率；图3 TaqMan Fast Advanced Master Mix检测准确度和灵敏度；图4 TaqMan Universal PCR Master Mix检测准确度和灵敏度；图5 AceQ qPCR Probe Master Mix检测准确度和灵敏度；图6 将标样Spike in到肝脏gDNA制作标曲得到的检测灵敏度和准确度；图7AceQ qPCR Probe Master Mix扩增的基质效应检测。
[0012]具体实施方式：为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。
[0013]实施例1 基因组DNA提取优化提高AAV基因组回收率优化前，按照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP30）的说明书操作，取30mg小鼠的性腺或肾脏组织加300μl无菌的1 X PBS，使用匀浆器65 Hz匀浆2分钟，然后各取5个50μl匀浆液（即5mg性腺或肾脏组织），向里面spike in 5E9,5E8,5E7,5E6和0个拷贝的目的基因AAV病毒。加150 μl缓冲液GA，20μl Proteinase K混匀，56℃孵育2 h，期间每隔半小时振荡混匀一次,然后加200 μl缓冲液GB混匀，70℃孵育10分钟。然后加200 μl无水乙醇，振荡混匀后室温放置10分钟，上吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中)，12000 rpm 离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中， 用600 μl 漂洗液PW洗2次，然后12,000 rpm 离心6分钟后，室温放置10分钟，用100μl预热的ddH2O洗两次。用TB Green
®ꢀ
Premix Ex Taq
™ꢀ
II qPCR Mix按照以下扩增体系进行AAV滴度检测：Template:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测SEQ ID NO.1的qPCR定量检测方法，其特征在于引物所选为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；taqman探针序列为SEQ ID NO.3，taqman探针5
’
端修饰为FAM，3
’
端修饰为BHQ1。2.如权利要求1所述的qPCR体系可用于组...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑竹霞，
申请(专利权)人：上海鼎新基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：