一种人鼻病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人鼻病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在人鼻病毒基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP

【技术实现步骤摘要】
一种人鼻病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术实施例涉及生物
，特别涉及一种人鼻病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]人鼻病毒(Human rhinovirus)属小RNA病毒科，是引起人类病毒性呼吸道感染的最常见病原体。自1956年Pelon等人分离培养出第一株人鼻病毒以来，已经鉴定了120多个血清型，是人类病毒中血清型最多的病毒。人鼻病毒主要通过直接接触传播和空气飞沫传播，人感染后常表现为感冒症状，主要包括流涕、打喷嚏、咽喉肿痛等，大约有10％～20％的成年人感冒是由人鼻病毒感染引起，而婴幼儿感冒有15％～30％是由人鼻病毒致病。人鼻病毒不仅可以引起上呼吸道感染，也可引起支气管炎、肺炎等下呼吸道疾病，部分患者如婴幼儿、老年人、免疫低下患者感染后病情相对较重，会发展成下呼吸道感染，有时会引起哮喘，充血性心衰，支气管扩张等严重并发症。因此，快速、准确的人鼻病毒的检测对于及时诊断病因，做到早发现早治疗，减少病情恶化具有重要意义。另外，人鼻病毒作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异，导致检测或治疗方法的失效；对于实验研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的毒株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。因此，开发快速、准确的、可监测变异的人鼻病毒检测分析方法对于人鼻病毒的临床治疗、防疫检测和科学研究和都具有重要意义。
[0003]经典的人鼻病毒检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组依赖于病原菌的分离培养和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音的局限，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异和免培养的优势。
[0004]现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。
[0005]因此，开发病原微生物人鼻病毒的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种人鼻病毒特异的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对人鼻病毒进行定性鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种人鼻病毒特异的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在人鼻病毒基因组上筛选的物种特异的、且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括：以MN369033.1为参考基因组上MNP
‑
1和MNP
‑
5的标记位点；以FJ445186.1为参考基因组上MNP
‑
2和MNP
‑
4的标记位点；以MN749147.1为参考基因组上MNP
‑
3的标记位点。
[0009]上述技术方案中，MNP
‑
1～MNP
‑
5的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
[0010]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括5对引物，所述5对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。
[0011]上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。
[0012]在本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测所述人鼻病毒MNP标记位点的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。
[0013]进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
[0014]在本专利技术的第四方面，提供了所述的人鼻病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在人鼻病毒非诊断目的定性检测和制备人鼻病毒定性检测产品中的应用。
[0015]在本专利技术的第五方面，提供了所述的人鼻病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在检测人鼻病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用。
[0016]在本专利技术的第六方面，提供了所述的人鼻病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建人鼻病毒数据库中的应用。
[0017]在本专利技术的第七方面，提供了所述的人鼻病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在人鼻病毒精细分型检测中的应用。
[0018]以上所述的应用中，应用步骤包括：首先是获取待测样本的病毒总RNA；利用商业化的反转录试剂盒反转录成cDNA；利用本专利技术的试剂盒对所述cDNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于25个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；测序结果比对到所述的人鼻病毒的参考序列上，获取在所述cDNA的检测序列数目和基因型数据。根据在所述cDNA和所述空白对照获得的人鼻病毒测序序列数量和检出MNP位点的数目，对所述cDNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得检出MNP位点数目、覆盖每个所述MNP位点的测序序列数目和所述MNP位点基因型数据。
[0019]当用于人鼻病毒鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的人鼻病毒的测序序列数量和检出MNP位点的数目，进行质控后判定待测样品中是否含有人鼻病毒的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的人鼻病毒的RNA为检测样本，评估所述试剂盒检测人鼻病毒的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测人鼻病毒时的质控方案和判定方法。
[0020]当用于人鼻病毒遗传变异检测时，包括毒株间和毒株内部的遗传变异检测。毒株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较毒株各自在5个MNP位点的基
因型数据。通过基因型比对，分析待比较毒株在所述5个MNP位点上的主基因型是否存在差异。若待比较毒株在至少一个MNP位点的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较毒株的5个位点分别进行扩增，然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较毒株每个MNP位点的基因型进行比对。如果存在主基因型不一致的MNP位点，则待比较毒株之间存在变异。当检测毒株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测毒株所述的MNP位点是否检出主基因型以外的次基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人鼻病毒的MNP标记位点，其特征在于，所述MNP标记位点为在人鼻病毒基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括：以MN369033.1为参考基因组上MNP
‑
1和MNP
‑
5的标记位点；以FJ445186.1为参考基因组上MNP
‑
2和MNP
‑
4的标记位点；以MN749147.1为参考基因组上MNP
‑
3的标记位点。2.一种用于检测权利要求1所述人鼻病毒MNP标记位点的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述多重PCR引物组合物包括5对引物，所述5对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。3.一种用于检测权利要求1所述人鼻病毒MNP标记位点的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈利红，李论，高利芬，方治伟，李甜甜，肖华锋，周俊飞，彭海，万人静，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：