CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用技术方案

本发明专利技术公开了CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用。构建了低场核磁共振(LFNMR)传感平台，实现了对SARS

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及领域，尤其涉及CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用。

技术介绍

[0002]为了有效控制疫情的发展，新冠肺炎疫情的检测非常重要。国内外各研究团队和机构已经开发了各种有效的新冠肺炎检测手段和工具。但各种检测方法的改进仍值得进一步探索。为了有效控制疫情的发展，新冠肺炎疫情的检测非常重要。国内外各研究团队和机构已经开发了各种有效的新冠肺炎检测手段和工具。在本次疫情中，我们可以通过流行病学病史、临床表现、核酸检测、基因测序和抗体检测，全面确定患者是否感染了Covid
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19。但要特别注意检测过程中的假阳性和假阴性问题。目前，Covid
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19的检测方法是缩短检测时间，简化检测步骤，降低检测成本，检测环境安全，准确检测结果。因此，对该检测方法的改进仍值得进一步探索。
[0003]基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器系统已经相继被开发出来，并已经检测到了多种靶点。如单核苷酸多态性、致病菌、转基因作物、Covid
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19和其他致病性病毒。一些CRISPR/cas12a检测平台经常将CRISPR系统与核酸扩增技术相结合，如PCR、LAMP、RPA、RAA等。核酸扩增技术的应用可以大大提高目标含量，从而大大提高CRISPR检测平台的灵敏度。利用CRISPR/Cas12a系统和RT
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LAMP技术，针对Covid<br/>‑
19的N基因和E基因，开发了基于胶体金检测论文的CRISPR/Cas12a检测平台。该法对Covid
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19检测有良好准确性和特异性。检测灵敏度最高可达10个拷贝/ul。还有采用RT
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RAA等温扩增技术、CRISPR/cas12a检测系统和磁珠上的生物传感器对信号进行扩增和转导，通过家用血糖仪输出信号，在10
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104拷贝/ul的浓度范围内实现定量检测，有良好检测准确性、特异性和实用性，不需要专业设备和复杂操作，然而，扩增导致检测时间长，检测成本高。
[0004]低场核磁共振(LF
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NMR)是核磁共振技术的延伸，是一种新兴技术，与核磁共振技术相比，LF
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NMR技术有较低的场强，其恒定场强低于0.5T。因为它的优点设备小，操作简单，分析成本低，重复性好，结果精度高，弥补和改善了核磁共振和其他分析方法和检测技术。但由于LF
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NMR技术的场强较低，虽能无损检测样品内部结构和各种指标，但却无法区分不同质子的化学位移，导致其对微量物质的检测仍受到一定的限制。因此，开发了一种检测介质来实现核磁共振，信号放大的功能将成为未来开发一种更灵敏、更高效的无损检测系统的热点。因此，测量纵向弛豫时间(T1)横向弛豫时间(T2)，扩散系数(d)用来反映样品中特定质子的运动特性，从而获得样品中目标成分的信息。采用核磁共振系统中的氢、碳磷谱和定量或二维核磁分析方法与统计分析相结合的方法进行检测。同时与传统的拉曼光谱、红外光谱、荧光、介电测试等技术进行比较，LF
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NMR检测技术更加多样化和方便，可以无破坏性、重复测定。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用，以解决上述技术问题。
[0006]为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案：CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，其在Covid
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19的快速检测的应用。
[0007]CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，病毒核酸提取试剂盒和逆转录放大cDNA通过RT
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RPA反应，然后二进制复杂Cas12和特定的引导RNA添加形成一个三联体与cDNA元复合物，从而激活Cas12a蛋白的反式裂解活性，通过制备不同粒径的磁性纳米颗粒，耦合单链DNA形成桥，制备了磁响应探针，由于不同粒径的磁性纳米颗粒在磁场作用下的磁性吸附力不同，实现两种不同粒径的分离，激活的Cas12a蛋白疯狂地切割磁性探针的桥链，触发磁性粒子的分散，根据不同的T2弛豫时间，利用低场核磁传感器探测器分析粒子的聚集和分散状态，通过改变T2弛豫时间检测病毒核酸。
[0008]CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统的制备方法，包括如下步骤：步骤1、氨基修饰的300nm超顺磁性纳米粒子的制备；使用分析天平称量7g1,6
‑
六甲基二胺，2gNaOAc和1gFeC
l3·
6H2O.将称量粉放入三颈瓶中混合，在三颈瓶中加入30毫升乙烯二胺后密封三颈瓶，瓶口涂抹密封油脂，将搅拌桨插入密封的三颈烧瓶中，放入50
°
C水浴中加热并搅拌5小时，将搅拌后得到的棕红色混合溶液转移到聚四氟乙烯反应器中并密封，置于205
°
C的高温烘箱中放置6小时。取出反应完成产生的黑色粉末，用50%乙醇溶液进行磁分离洗涤，反复4次，充分洗脱材料表面的有机溶剂，将洗过的混合物放入烤箱，在50
°
C下干燥6小时，在确认粉末足够干燥后，收集粉末并储存在一个密封的容器中；步骤2、370nm氨基改性硅涂层超顺磁性纳米颗粒的制备；使用分析天平称出423毫克铁(ac)3，放入100毫升四颈瓶中，加入15毫升油胺，在磁力搅拌器上搅拌，慢慢将温度升高至140
°
C，并保持30min，在此期间，保持氩气的流动，直到溶液变黑，当溶液变黑时，搅拌温度迅速升高到330
°
C，继续搅拌1小时，然后停止搅拌，将溶液冷却至室温后，加入20ml乙醇溶解沉淀颗粒，通过磁性分离溶液，丢弃上清液来分离磁性粒子，用无水乙醇清洗磁性颗粒两次，后用正己烷清洗三次，将所得产品放入烤箱，调整温度至50
°
C，干燥24小时；将获得的四氧化三铁磁性纳米颗粒用二氧化硅修饰并与氨基结合，用分析天平称重制备的600mg四氧化三铁磁性纳米颗粒，并放入三颈瓶中。首先，在超声波清洗器中，超声波分散10分钟。在超声处理后的磁性颗粒中加入41.5ml纯水和37.5ml无水乙醇，继续超声处理10分钟。超声处理后，加入氨水20ml和TEOS4ml。在三颈烧瓶中加入一个磁铁，用一个磁力搅拌器以200rpm的速度进行2小时的搅拌反应。反应结束后，用乙醇洗涤磁性颗粒3次，置于70℃的烤箱中，干燥6小时。
[0009]步骤3、磁响应探针的制备；准备实验所需的HEPES缓冲液，用分析天平称量氯化镁和氯化钠，使最终缓冲系统包含25mmol氯化镁和10mmol氯化钠，然后使用pH试剂使最终pH为7.2。将购买的单链DNA在离心机中离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟。取出后，加
入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，其特征在于，其在covid
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19的快速检测的应用。2.CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，其特征在于，病毒核酸提取试剂盒和逆转录的cDNA通过RT
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RPA反应，CRISPR/cas12a系统和特定的引导RNA添加形成一个三联体与cDNA元复合物，从而激活Cas12a蛋白的反式裂解活性，通过制备不同粒径的磁性纳米颗粒，耦合单链DNA形成桥，制备了磁响应探针，由于不同粒径的磁性纳米颗粒在磁场作用下的磁性吸附力不同，实现两种不同粒径的分离，激活的Cas12a蛋白可切割磁性探针的桥链，触发磁性粒子的分散，根据不同的T2弛豫时间，利用低场核磁传感器探测器分析粒子的聚集和分散状态，通过改变T2弛豫时间检测病毒核酸。3.CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、氨基修饰的300nm超顺磁性纳米粒子的制备；使用分析天平称量7g1,6
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六甲基二胺，2gNaOAc和1gFeC
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6H2O.将称量粉放入三颈瓶中混合，在三颈瓶中加入30毫升乙烯二胺后密封三颈瓶，瓶口涂抹密封油脂，将搅拌桨插入密封的三颈烧瓶中，放入50
°
C水浴中加热并搅拌5小时，将搅拌后得到的棕红色混合溶液转移到聚四氟乙烯反应器中并密封，置于205
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C的高温烘箱中放置6小时，取出反应完成产生的黑色粉末，用50%乙醇溶液进行磁分离洗涤，反复4次，充分洗脱材料表面的有机溶剂，将洗过的混合物放入烤箱，在50
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C下干燥6小时，在确认粉末足够干燥后，收集粉末并储存在一个密封的容器中；步骤2、370nm氨基改性硅涂层超顺磁性纳米颗粒的制备；使用分析天平称出423毫克铁(ac)3，放入100毫升四颈瓶中，加入15毫升油胺，在磁力搅拌器上搅拌，慢慢将温度升高至140
°
C，并保持30min，在此期间，保持氩气的流动，直到溶液变黑，当溶液变黑时，搅拌温度迅速升高到330
°
C，继续搅拌1小时，然后停止搅拌，将溶液冷却至室温后，加入20ml乙醇溶解沉淀颗粒，通过磁性分离溶液，丢弃上清液来分离磁性粒子，用无水乙醇清洗磁性颗粒两次，后用正己烷清洗三次，将所得产品放入烤箱，调整温度至50
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C，干燥24小时；将获得的四氧化三铁磁性纳米颗粒用二氧化硅修饰并与氨基结合，用分析天平称重制备的600mg四氧化三铁磁性纳米颗粒，并放入三颈瓶中，首先在超声波清洗器中，超声波分散10分钟，在超声处理后的磁性颗粒中加入41.5ml纯水和37.5ml无水乙醇，继续超声处理10分钟，超声处理后，加入氨水20ml和TEOS4ml，在三颈烧瓶中加入一个磁铁，用一个磁力搅拌器以200rpm的速度进行2小时的搅拌反应，反应结束后，用乙醇洗涤磁性颗粒3次，置于70℃的烤箱中，干燥6小时；步骤3、磁响应探针的制备；准备实验所需的HEPES缓冲液，用分析天平称量氯化镁和氯化钠，使最终缓冲系统包含25mmol氯化镁和10mmol氯化钠，然后使用pH试剂使最终pH为7.2，将购买的单链DNA在离心机中离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟，取出后，加入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度为100μmol，用分析天平称重EDC和NHS，然后用PBS制备终浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晔，赵晓雯，闫清，毕庆庆，牟晓峰，
申请(专利权)人：青岛市中心医院，
类型：发明
国别省市：