复制增强的溶瘤腺病毒制造技术

本发明专利技术公开了复制增强的溶瘤腺病毒。这些溶瘤腺病毒具有能够增强肿瘤溶瘤和增强治疗性转基因表达的肿瘤特异性复制能力。还公开了方法，包括对患有癌症的患者给药复制增强的溶瘤腺病毒。瘤腺病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】复制增强的溶瘤腺病毒
[0001]联合研究协议
[0002]本专利技术是在联合研究协议范围内开展的活动的结果，该协议在本专利技术做出时生效。上述联合研究协议的双方为曼珍公司(Memgen，Inc.)(前身为Memgen，LLC)和H
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李
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莫菲特癌症中心和研究所公司(H.Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute,Inc.)。
[0003]专利技术背景
专利

[0004]本专利技术通常涉及溶瘤病毒和肿瘤学领域。更具体地，本专利技术涉及用于治疗癌症的在肿瘤细胞中具有增强的病毒复制的溶瘤病毒组合物。
[0005]现有技术描述
[0006]溶瘤病毒是一类具有双重作用机制的癌症治疗剂：1)通过肿瘤细胞中的选择性病毒复制杀死肿瘤细胞，导致直接的肿瘤溶解；2)通过从被破坏的肿瘤细胞中释放抗原诱导全身抗肿瘤免疫。原生病毒和基因修饰病毒都在研发中。美国FDA于2015年批准了第一种溶瘤病毒talimogene laherparepvec(IMLAmgen Inc.，Thousand Oaks，CA)，一种用于黑色素瘤局部治疗的编码粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)的基因修饰的疱疹病毒，如Kohlhapp等人于2016年临床癌症研究所述的。然而，疱疹病毒只是正在对其溶瘤特性进行研究的许多溶瘤病毒中的一种。
[0007]溶瘤腺病毒载体因几种原因被广泛用于癌症基因治疗，包括多种肿瘤类型感染的广泛倾向性、载体稳定性、高滴度制造和纯化病毒的能力、转基因携带能力、缺乏与宿主基因组的整合以及良好的安全性特征。
[0008]尽管溶瘤腺病毒载体具有这些理想的属性，但由于多种原因，这些载体在癌症治疗中的应用也受到限制，包括正常细胞中的非特异性感染和复制、缓慢或低的病毒复制率、抗腺病毒免疫原性导致的载体清除和中和，以及低溶瘤能力。当用作递送载体时，这些限制也会导致基因转移或表达效率低下。
[0009]这些努力的目的是改善具有复制能力的腺病毒，以解决其局限性。这些努力包括修饰腺病毒基因组组分，以在肿瘤细胞中进行选择性复制。特征明确的修饰包括腺病毒E1A基因(δ
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24E1A)的24碱基对缺失、E1B 55K病毒基因的缺失，甚至用肿瘤相关抗原启动子(如甲胎蛋白启动子或前列腺抗原启动子)替换病毒启动子(如E1A)。
[0010]尽管有这些选择性肿瘤靶向的实例，但现有技术缺乏在肿瘤细胞中以显著提高的速率或水平复制的重组腺病毒载体。
[0011]因此，仍然需要溶瘤病毒载体来改善其主要作用机制之一：选择性增强肿瘤细胞中的病毒复制，从而改善肿瘤溶解。本专利技术解决了对溶瘤腺病毒载体的这种需求，该载体具有增强的肿瘤细胞中的病毒复制、改进的肿瘤溶解和改进的治疗性转基因表达。
[0012]背景中讨论的所有主题不一定都是现有技术，也不应仅仅因为背景中的讨论而被假定为现有技术。沿着这些路线，对背景中讨论的现有技术中的问题或与此类主题相关的
问题的任何承认不应被视为现有技术，除非明确声明为现有技术。相反，在背景中对任何主题的讨论都应该被视为专利技术人解决特定问题的方案的一部分，这本身也可能具有创造性。

技术实现思路

[0013]以下为本专利技术的简要概述，以提供对本专利技术某些方面的基本理解。该内容并非对本专利技术的详尽概述。其目的不是确定本专利技术的关键或关键要素，或描述本专利技术的范围。其唯一目的是以简化的形式呈现一些构思，作为后面讨论的更详细描述的序幕。
[0014]我们惊奇地发现，在腺病毒基因组中插入两个外源性启动子/增强子元件(CMV启动子/增强子和SV40早期启动子/增强子)，以及之前描述的腺病毒E1A、E1B和E3基因组分的修饰，可显著增强肿瘤细胞中的病毒复制，并增强肿瘤溶解。我们还惊讶地发现，这种新描述的重组腺病毒可以作为一种载体，用于递送一种或多种治疗性转基因，从而显著增强这些转基因在肿瘤细胞中的表达效果。虽然CMV启动子/增强子或SV40启动子/增强子的单独使用已被独自用于生成重组溶瘤腺病毒，但我们不知道描述启动子在溶瘤病毒中的双重使用的任何现有技术，我们不知道描述我们意外发现的这种双启动子溶瘤腺病毒将导致增强的肿瘤特异性病毒复制的现有技术。
[0015]在一些实施方式中，本专利技术涉及具有赋予病毒复制增强的病毒基因组修饰的溶瘤腺病毒。
[0016]在一些实施方式中，重组溶瘤腺病毒包含插入病毒基因组中的CMV启动子/增强子和SV40启动子/增强子。
[0017]在一些实施方式中，重组溶瘤腺病毒包含插入病毒基因组中的CMV启动子/增强子和SV40启动子/增强子，具有E3编码区的部分或全部缺失，具有包含δ
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24缺失的E1A基因，并包括E1B 55K缺失。
[0018]在优选实施方式中，重组溶瘤腺病毒包含插入腺病毒E1编码区上游非编码区的CMV启动子/增强子，包含插入腺病毒E3区的SV40启动子/增强子，具有E3编码区的部分或全部缺失，并且具有包含δ
‑
24缺失的E1A基因；并且包括E1B 55K缺失。
[0019]本专利技术的其他实施方式包括编码一种或多种治疗性蛋白的异源核酸序列。
[0020]在一些实施方式中，本专利技术提供了一种溶瘤腺病毒，其具有针对肿瘤细胞的增强的病毒复制。
[0021]在进一步的实施方式中，本专利技术提供了通过给药复制增强的重组溶瘤腺病毒来治疗恶性肿瘤、优选癌症的方法。
[0022]下面的描述中阐述了一种或多种实施方式的细节。结合一种示例性实施方式所示或描述的特征可以与其他实施例方式的特征相结合。因此，本文描述的各种实施方式中的任何一种都可以组合以提供进一步的实施方式。如有必要，可以修改实施方式的各个方面，以采用本文所识别的各种专利、申请和出版物的概念，以提供进一步的实施方式。其他特征、目的和优点将从说明书、附图和权利要求书中显而易见。
[0023]附图的简要说明
[0024]本专利技术可以通过参考以下描述结合附图来理解，其中：
[0025]图1示意性地示出了一种复制增强的溶瘤腺病毒，其具有插入腺病毒基因组中的CMV启动子/增强子和SV40启动子/增强子；和用于插入异源核酸以表达一种或多种治疗性
蛋白的区域。
[0026]图2示意性地示出了一种复制增强的溶瘤腺病毒，其具有插入腺病毒E1编码区上游的非编码区的CMV启动子/增强子、插入腺病毒E3区的SV40启动子/增强子、额外的病毒基因组修饰物，和用于插入异源核酸以表达一种或多种治疗性蛋白的区域。
[0027]图3示意性地示出了编码两个转基因：嵌合CD40配体(MEM40)和IFN
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beta(IFNβ)的复制增强的溶瘤腺病毒(MEM
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288)。
[0028]图4示出了不同肿瘤细胞在感染编码两个转基因(MEM40和IFNβ)的复制增强的溶瘤腺病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种病毒复制增强的重组腺病毒载体，其包含插入腺病毒基因组中的CMV启动子/增强子和SV40启动子/增强子。2.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述重组腺病毒载体包含：a.插入腺病毒E1编码区上游的非编码区的CMV启动子/增强子；和b.插入腺病毒E3区的SV40启动子/增强子；和c.E3编码区的部分或全部缺失；和d.包含δ
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24缺失的E1A基因；和e.E1B 55K缺失。3.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述腺病毒是血清型5。4.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述CMV启动子/增强子位于左侧反向末端重复序列(ITR)和功能E1A区的5
’
端之间。5.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述SV40启动子/增强子位于E3 12.5K和E3 RID
‑
α区之间。6.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述CMV启动子/增强子区可操作地连接至异源核酸序列。7.根据权利要求6所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述异源核酸序列编码一种或多种治疗性蛋白。8.根据权利要求7所述的复制增强的腺病毒载体，其中，编码治疗性蛋白的所述异源核酸选自由编码细胞因子、趋化因子、抗体、前药转化酶和免疫调节蛋白的基因组成的组。9.根据权利要求1所述的复制增强的腺病毒载体，其中，所述SV40启动子/增强子区可操作地连接至异源核酸序列。10.根据权利要求9所述的复制增强的腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克，
申请(专利权)人：H，
类型：发明
国别省市：