一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法技术

本发明专利技术公开一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明专利技术以MMP2基因启动子区DNA甲基化以及MMP2基因为研究对象，通过分析MMP2基因在卵泡发育过程中的表达与甲基化水平的关联，然后利用5

【技术实现步骤摘要】
一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法


[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法。

技术介绍

[0002]表观遗传修饰是研究基因表达的热点，其中DNA甲基化是研究最多和最为深入的表观遗传修饰之一。DNA甲基化是指基因组胞嘧啶
‑
鸟嘌呤二核苷酸(CpG)，在DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下，共价结合一个游离的甲基形成5
‑
甲基胞嘧啶的过程。细胞中染色体结构、DNA构象和稳定性以及DNA与蛋白质互作方式都可能受DNA甲基化水平的影响。在哺乳动物中，高甲基化的启动子和增强子可以在基因转录中发挥重要的作用。有研究表明，DNA甲基化会影响包括凋亡在内的不同细胞信号通路基因的表达，进而影响颗粒细胞的功能。用甲基转移酶抑制剂5
‑
Aza
‑
CdR处理雌性小鼠后，能诱导卵泡闭锁和抑制卵泡成熟，进而显著延缓小鼠的初情启动日龄。综上所述，DNA甲基化可能通过调控颗粒细胞内关键基因的表达进而影响哺乳动物卵泡的发育和初情启动。
[0003]基质金属蛋白酶2基因(Matrix metalloproteinases 2，MMP2)是MMps家族的重要成员，又称明胶酶A，为Ⅳ型胶原酶的一种。MMP2编码的蛋白酶能分解卵泡液中的明胶蛋白、纤维蛋白和IV型胶原蛋白等蛋白，影响卵泡内颗粒细胞的凋亡和增殖，进而影响雌性动物的繁殖能力。

技术实现思路

[0004]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法，通过调节MMP2基因启动子区DNA甲基化水平，实现猪卵巢颗粒细胞中MMP2基因转录活性的调控。
[0007]进一步地，所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化为MMP2基因启动子区中BSP1甲基化和/或BSP2甲基化；所述的BSP1为MMP2基因启动子
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1884～
‑
1654bp区域，所述的BSP2为MMP2基因启动子
‑
1381～
‑
1148bp区域；
[0008]所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化水平降低，MMP2基因转录活性升高。
[0009]更进一步地，所述的BSP1甲基化的位点为第10个CG位点，所述的BSP2甲基化的位点为第2个CG位点。
[0010]更进一步地，所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化水平降低通过DNA甲基转移酶抑制剂5
‑
Aza
‑
CdR或RNA干扰技术抑制DNA甲基转移酶DNMT3A或DNMT3B的表达实现，其中：
[0011]采用的抑制DNMT3A的siRNA如下：
[0012]DNMT3A
‑
siRNA：5
′‑
ACCCTTACAAAGAAGTTTACA
‑3′
；
[0013]采用的抑制DNMT3B的siRNA如下：
[0014]DNMT3B
‑
siRNA：5
′‑
CTCATTTTATCTTCTAAAACT
‑3′
。
[0015]一种猪卵巢颗粒细胞MMP2基因的核心启动子功能调节区，为MMP2基因启动子
‑
1884～
‑
1654bp区域或
‑
1381～
‑
1148bp区域。
[0016]一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的核酸片段，为DNA甲基转移酶DNMT3A或DNMT3B的siRNA，所述siRNA为如下序列中的任意一种：
[0017]DNMT3A
‑
siRNA：5
′‑
ACCCTTACAAAGAAGTTTACA
‑3′
；
[0018]DNMT3B
‑
siRNA：5
′‑
CTCATTTTATCTTCTAAAACT
‑3′
。
[0019]上述核心启动子功能调节区或上述核酸片段在调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达中的应用。
[0020]本专利技术前期通过分析全基因组DNA甲基化测序数据，发现MMP2基因启动子的DNA甲基化水平与母猪初情启动密切相关，且在初情启动延缓母猪的卵巢中MMP2基因的mRNA表达水平显著高于初情正常母猪的卵巢。同时通过网站预测发现MMP2启动子存在两个CpG岛。由此我们提出假设DNA甲基化可能调控MMP2基因的转录水平。
[0021]本专利技术的验证结果如下：
[0022]1、通过生物信息学网站预测MMP2基因启动子区(
‑
2142～+191，+1为转录起始位点)的CpG岛。由图1结果可知，MMP2基因启动子区存在两个CpG岛。
[0023]2、我们分离了小卵泡(≤3mm)、中卵泡(3～5mm)以及大卵泡(≥5mm)的颗粒细胞，利用qRT
‑
PCR、Western Blot以及BSP分别检测MMP2基因在各阶段卵泡中的表达和甲基化水平。qRT
‑
PCR和Western Blot结果显示，随着卵泡不断发育增大，MMP2基因的mRNA和蛋白表达水平逐步降低。BSP结果显示，随着卵泡不断发育增大，MMP2基因启动子BSP1第10个CG位点和BSP2第2个CG位点的甲基化水平逐渐升高(图2)。综上，DNA甲基化可能参与MMP2基因的表达。
[0024]3、我们分别用5
‑
Aza
‑
CdR或DNMT1
‑
siRNA处理卵巢颗粒细胞，利用qRT
‑
PCR、Western Blot和BSP分别检测MMP2基因的表达和甲基化水平。qRT
‑
PCR和Western Blot结果显示，5
‑
Aza
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CdR能显著促进MMP2基因的mRNA和蛋白表达水平，同时，BSP结果显示，5
‑
Aza
‑
CdR能降低MMP2基因启动子BSP1第10个CG位点和BSP2第2个CG位点的甲基化水平，而DNMT1
‑
siRNA对MMP2基因表达的影响差异不显著(图3)。综上，DNMT1可能不是影响MMP2基因表达的主要酶类。
[0025]4、我们接着又分别转染甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B的小干扰RNA(DNMT3A
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siRNA和DNMT3B
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siRNA)至颗粒细胞中，利用qRT
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PCR、Western Blot以及BSP分别检测MMP2基因的表达和甲基化水平。qRT
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PCR和We本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化调控MMP2基因转录的方法，其特征在于：通过调节MMP2基因启动子区DNA甲基化水平，实现猪卵巢颗粒细胞中MMP2基因转录活性的调控；所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化为MMP2基因启动子区中BSP1甲基化和/或BSP2甲基化；所述的BSP1为MMP2基因启动子
‑
1884～
‑
1654bp区域，所述的BSP2为MMP2基因启动子
‑
1381～
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1148bp区域。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化水平降低，MMP2基因转录活性升高。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的BSP1甲基化的位点为第10个CG位点，所述的BSP2甲基化的位点为第2个CG位点。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的MMP2基因启动子区DNA甲基化水平降低通过DNA甲基转移酶抑制剂5
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Aza
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CdR或RNA干扰技术抑制DNA甲基转移酶DNMT3A或DNMT3B的表达实现。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用的抑制DNMT3A的siRNA如下：DNMT3A
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siRNA：5
′‑
ACCCTTACAAAGAAGTTTACA
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓龙，李泳光，李加琪，方明，吕嫒媛，张哲，张豪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：