一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸及其应用，其中反义寡核苷酸序列与linc00520转录物内的核酸片段序列至少85％互补，所述反义寡核苷酸的序列长度为10至30个核苷酸。本发明专利技术通过靶向长链非编码RNA linc00520设计并合成ASO，其能够降低linc00520的表达水平，并且显著抑制黑素瘤细胞的增殖，迁移和侵袭能力，对于开发新的抗皮肤黑素瘤基因药物具有重要意义，具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。用前景和巨大的经济价值。用前景和巨大的经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸及其应用。

技术介绍

[0002]长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类长度大于200nt且不具备蛋白质编码能力的RNA。因为其不编码蛋白质，很长一段时间，人们误以为lncRNA是翻译过程中的“噪音”。随着对lncRNA的深入研究，发现lncRNA是动、植物体内重要的调节子，其可以在转录、翻译、生长发育，参与非生物胁迫等多个水平上调控基因的表达，成为当前研究的热点。
[0003]皮肤黑色素瘤是黑色素细胞发生突变形成的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，进展快，致死率高，为一种最具威胁性的皮肤肿瘤。另外，该病在全球各地的发病率呈逐年递增趋势。近年来，随着诊疗技术的不断进步，针对BRAF，c
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kit等基因突变的靶向治疗以及以PD
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1，CTLA
‑
4为代表的免疫治疗使皮肤黑素瘤患者的死亡率等到一定程度的缓解，但治疗效果仍不理想。一方面，部分病人仍缺乏临床上可靶向的基因，另外大量患者对靶向，免疫治疗等治疗手段的应答率低或易产生耐药复发，毒副作用大等。因此，研发新的分子标志物，治疗靶点及干预药物和手段仍是仍是黑素瘤领域的研究重点。
[0004]近年来越来越多的研究表明lncRNAs在黑素瘤的发生发展以及药物耐受中发挥重要作用，可参与调节多种细胞生物学活动，包括细胞增殖，凋亡，迁移与侵袭，能量代谢，新血管生成等。抑制或过表达一些lncRNA能够起到抗癌的作用。靶向lncRNA的表达或功能可为皮肤黑素瘤的治疗提供了一种新的策略。另外，lncRNAs具有较高的组织特异性、高效率和高稳定性，有望成为诊断和预后的潜在治疗靶点和生物标志物。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题：提供干预linc00520基因的反义寡聚核苷酸以及靶向linc00520基因的反义寡聚核苷酸在制备治疗皮肤黑色素瘤药物中的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下的技术方案：
[0007]一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸序列与linc00520转录物内的核酸片段序列至少85％互补，所述反义寡核苷酸的序列长度为10至30个核苷酸。
[0008]优选地，所述反义寡核苷酸包含如下序列：5
′‑
GTTCT TGTGA ATTGC AGTCC
‑3′
；5
′‑
ATAGG TCTCT TGAAA CATGG
‑3′
；5
′‑
GGTTT GCTGA GCTGT AGAAT
‑3′
中的至少一种。
[0009]一种linc00520抑制剂，包含上述反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与linc00520转录物特异性结合并抑制linc00520基因表达。
[0010]一种抗皮肤黑色素瘤药物组合物，包含上述反义寡核苷酸，以及药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂；所述载体包括慢病毒载体，腺病毒载体，或其他非病毒质粒载体。
[0011]本专利技术获得的有益效果：
[0012]本专利技术通过靶向长链非编码RNA linc00520设计并合成ASO，其能够降低linc00520的表达水平，并且显著抑制皮肤黑素瘤细胞的增殖，迁移和侵袭能力，对于开发新的抗皮肤黑素瘤基因药物具有重要意义，具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。
附图说明
[0013]图1表示通过RT
‑
qPCR检测发现linc00520在皮肤黑素瘤组织和细胞中表达显著上调。其中，以GAPDH作为内参照。左上图显示相对于皮肤痣，linc00520在皮肤黑素瘤中明显表达上调。group 1:皮肤痣；group2:皮肤黑素瘤。***p<0.001。右上图表示linc00520在皮肤黑素瘤细胞中表达升高。MC：人原代皮肤黑素细胞(human primary melanocyte)。左下图，右下图分别为代表性扩增曲线及linc00520引物的熔解曲线。
[0014]图2显示ASO可以抑制人皮肤黑素瘤细胞内linc00520基因的表达。相对于阴性对照转染组，ASO
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520
‑
1，ASO
‑
520
‑
2，ASO
‑
520
‑
3可下调人皮肤黑素瘤细胞内linc00520的表达水平。
[0015]图3显示通过CCK8实验检测linc00520
‑
ASO转染后对皮肤黑素瘤细胞增殖的影响。相对于空白转染组(BLANK)及阴性对照转染组(Negative control),linc00520
‑
ASO(ASO
‑
520)可显著抑制皮肤黑素瘤细胞的增殖。**p<0.01。
[0016]图4显示linc00520
‑
ASO转染皮肤黑素瘤细胞48h后，经transwell实验检测发现，相对于空白转染组(Blank)及阴性对照组(Negative control)，黑素瘤细胞的迁移及侵袭能力均显著下降。**p<0.01。
具体实施方式
[0017]下面通过对实施例的描述，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0018]实施例1：实时定量PCR检测linc00520在皮肤黑素瘤组织和细胞中的表达
[0019]1实验材料
[0020]本专利技术所用人皮肤黑素瘤细胞A375、Sk
‑
mel
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28，MV3购自中科院细胞库，人原代皮肤黑素细胞MC为本实验室保存。高糖DMEM液体培养基，胎牛血清和胰酶购自invitrogen公司。20例皮肤黑素痣及30例皮肤黑素瘤组织为中国医学科学院皮肤病医院皮肤生物样本库保存，均经病理组织学确诊，采集样本过程严格遵守人体试验规定，满足伦理委员会标准及签署患者知情同意书。
[0021]2实验方法
[0022]1)细胞培养：细胞采用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，细胞放置于37℃、95％湿度、5％CO2浓度的恒温培养箱内培养，当细胞生长至融合度为80
‑
90％左右时，胰酶消化并传代或冻存，取生长状态良好的细胞用于实验。
[0023]2)组织/细胞RNA提取：
[0024]①
取50
‑
100mg组织(新鲜或
‑
80度冰箱保存的组织)置于1.5ml离心中，加入1ml trizol充分匀浆，室温静置5min。对于细胞，则收获1
‑5×
107个细胞，加入1ml trizol,混匀，室温静置5min。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸序列与linc00520转录物内的核酸片段序列至少85％互补，所述反义寡核苷酸的序列长度为10至30个核苷酸。2.根据权利要求1中所述的一种靶向长链非编码RNA的反义寡核苷酸，其特征在于：所述反义寡核苷酸包含如下序列：5
′‑
GTTCTTGTGAATTGCAGTCC
‑3′
；5
′‑
ATAGGTCTCTTGAAACATGG
‑3′
...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪娜娜，孙建方，姜祎群，陈浩，程伟，
申请(专利权)人：中国医学科学院皮肤病医院中国医学科学院皮肤病研究所，
类型：发明
国别省市：