一种油菜长链非编码RNA基因及其在提高油菜种子粒重中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种油菜长链非编码RNA基因MSTRG.22563，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过获得过表达材料，分析转基因材料的千粒重，发现MSTRG.22563基因提高甘蓝型油菜种子粒重。本发明专利技术进一步提供了一种提高油菜种子粒重的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有MSTRG.22563基因的过表达载体转化到作物的基因组中，获得MSTRG.22563基因过表达的油菜品种。本发明专利技术在油菜高产育种中具有潜在的应用价值。在的应用价值。在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种油菜长链非编码RNA基因及其在提高油菜种子粒重中的应用


[0001]本专利技术属于分子育种领域，具体涉及一种油菜长链非编码RNA基因MSTRG.22563，本专利技术还涉及该基因在调控油菜种子粒重中的应用。

技术介绍

[0002]长链非编码RNA(lncRNAs)最初被认为是没有任何功能的转录垃圾，自从20世纪80年代末发现H19在哺乳动物中具有RNA的功能后，lncRNAs在生物体内的作用受到更多的关注。在过去的几十年里，越来越多的lncRNAs被发现在维持动物细胞的正常功能中发挥关键作用。最近，许多植物中也发现了大量的lncRNAs，如在拟南芥、水稻、棉花、花生、玉米和油菜中分别预测出6480、2224、14749、50873、20163和3181个lncRNAs。植物中的一些lncRNAs的功能特征与植物的生长、发育以及对非生物和生物压力的反应有关。
[0003]油菜籽是世界上第三大油料作物，约占全球油料产量的13％。油菜产量构成的三个因素是指单位面积上的角果数、每角果粒数和粒重。所以提高油菜粒重直接影响油菜产量。粒重是受多基因控制的数量性状，同时受到环境和基因型的调控。
[0004]本专利技术从油菜中克隆了长链非编码RNA基因MSTRG.22563，研究表明，将MSTRG.22563基因在油菜中过表达可以显著提高油菜的种子粒重，可为油菜高产育种提供理论依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于提供一种油菜长链非编码RNA基因，申请人将其命名为MSTRG.22563基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为246bp。申请人通过对油菜lncRNAs进行大量筛选和鉴定最终得到该基因，可采用PCR技术从油菜基因组、mRNA和cDNA中扩增以获得。
[0006]本专利技术进一步提供一种克隆该基因的方法，包括以下步骤：
[0007](1)从油菜种子中提取总RNA；
[0008](2)反转录成cDNA；
[0009](3)设计正、反向引物，从cDNA中扩增目的基因。
[0010]其中，正向引物：5
’‑
GCGACTAGT CGTCGAGCTCGGTAGCGTG
‑3’
(SEQ ID NO:2)
[0011]反向引物：5
’‑
GCGTTCGAA CCCCGTTATCCTTCCACCGT
‑3’
(SEQ ID NO:3)
[0012]本专利技术还提供了含有所述油菜长链非编码RNA基因的重组质粒和重组菌。
[0013]利用本专利技术提供的油菜长链非编码RNA基因、重组质粒或重组菌，可以对油菜进行分子育种并提高油菜种子粒重。
[0014]本专利技术进一步提供一种提高油菜种子粒重的方法：使用农杆菌介导的遗传转化方法将含有油菜长链非编码RNA基因的过表达重组质粒转化到油菜的基因组中，获得油菜长链非编码RNA基因超表达的油菜品种，其中，所述油菜长链非编码RNA基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO:1所示。
[0015]本专利技术所使用的载体质粒是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本专利技术过表达重组质粒的载体包括但不限于PMDC83等。
[0016]本专利技术的一个特点在于通过获得过表达材料，分析了转化材料的千粒重，发现MSTRG.22563正调控油菜种子千粒重。
[0017]本专利技术获得的高粒重过表达油菜植株，该植株在油菜高产育种中具有潜在的应用价值。
附图说明
[0018]图1：MSTRG.22563基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0019]图2：构建的植物表达载体pMDC83
‑
MSTRG.22563的质粒图谱。
[0020]图3：油菜转化单株的qRT
‑
PCR检测。OE4、OE5、OE6、OE7和OE8是基因MSTRG.22563的超表达株系。每个株系有3个不同单株，**表示在Student
’
s t test中P<0.01，*表示P<0.05。
[0021]图4：MSTRG.22563在油菜的表型鉴定。利用千粒重仪分析油菜种子的千粒重，OE4、OE5和OE7是基因MSTRG.22563的超表达株系。每个株系有8
‑
12个不同单株，*表示在Student
’
s t test中P<0.05。
具体实施方式
[0022]以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于解释本专利技术而不是用于限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法予以实施。
[0023]实施例1MSTRG.22563基因的克隆
[0024](1)RNA的提取
[0025]总RNA的提取采用全式金公司的TransZol(目录号ET101)，提取方案遵从试剂盒使用说明书。需要提前准备的试剂有RNase
‑
free水、氯仿、异丙醇和75％乙醇(由DEPC处理的水配制)，所用试剂和实验用品均经过DEPC灭活RNA酶处理。具体步骤如下：
[0026]a.取甘蓝型油菜的发育中种子于液氮中充分研磨直至粉末状，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml TransZol，之后上下剧烈震荡使之充分混匀，进行匀浆处理，之后室温静置5分钟；
[0027]b.向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；
[0028]c.10，000
×
g 4℃离心15分钟；
[0029]d.将上层无色的水相转移至新的离心管中(体积大约为0.6ml)，加入0.5ml经过预冷的异丙醇并颠倒混匀，室温孵育10分钟；
[0030]e.10，000
×
g 4℃离心10分钟，倒去上清，离心管侧壁和底部形成沉淀；向离心管中加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，剧烈涡旋；
[0031]f.7，500
×
g 4℃离心5分钟，去上清，室温晾干沉淀15分钟左右；
[0032]g.将沉淀溶于50
‑
100μl RNA溶解液中，55
‑
60℃孵育10分钟，保存于
‑
80℃冰箱中备用。
[0033]h.取1μl抽提的总RNA在Nanodrop下测定RNA浓度和质量，依据1.8<OD260/OD280<2.0鉴定RNA纯度。同时取1μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测完整性和质量。
[0034](2)RNA反转录
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油菜长链非编码RNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.用于扩增权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。3.含有权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的重组质粒。4.含有权利要求1所述油菜长链非编码RNA基因的重组菌。5.权利要求1所述的油菜长链非编码RNA基因、权利要求3所述的重组质粒、权利要求4所述的重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁少平，郭亮，李雨晴，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：