采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，属于医疗检测试剂制备领域。包括氧化锌

【技术实现步骤摘要】
采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法


[0001]本专利技术涉及医疗检测试剂制备领域的一种技术，尤其涉及免疫层析方法学的试纸条制备中对硝酸纤维素膜(NC)膜特殊处理、标记物与抗体交联一种技术方法；经过上述处理后，能够解决待测物在NC膜上均匀分布、以及提高NC膜的吸附效果，同时也改变了标记物与抗体结合方式，提高抗体标记效率，从而提高了产品灵敏度、精准度、稳定性，降低了产品批内差。

技术介绍

[0002]免疫层析技术是在20世纪60年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,利用胶体金、胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料、纳米微球、荧光微球、量子点等着色标记物,在层析时,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线,以纤维膜上显色条带的有无、颜色深浅和反射光线来定性或定量，广泛应用于各类快检项目中。
[0003]在免疫层析检测中，蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂；由于检测结果完全取决于捕获试剂在NC膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在NC膜上均一、良好的吸附对标记物检测结果非常重要；蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂，在实际应用过程中NC会出现“咖啡环效应”，即抗原的识别区域呈现边缘浓度远高于中间浓度的不均匀现象，导致所得印迹常常呈现环状，非常不利于进行后续的准确定量分析。一般而言，“咖啡环效应”的影响随着抗原浓度的降低而愈专利技术显。由于检测结果完全取决于捕获试剂在NC膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在NC膜上均一、良好的吸附对标记物检测结果非常重要。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么蛋白吸附时发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释、难以达到精准，在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，更难以解释检测结果。
[0004]其次在免疫层析检测中，标记物和抗体之间的结合采用的是简单的物理吸附方法，抗体非常容易从标记物表面脱落下来，导致标记物不稳定。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、蛋白在NC膜上分布不均一、结合力不强、以及抗体标记效率低的问题，从而提高产品稳定性、灵敏度、准确率，降低了产品批内差。
[0006]本专利技术采取的技术方案是，包括下列步骤：
[0007](a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备
[0008]1)N
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羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10
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12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然
后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N
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羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
[0009]2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·
2H2O溶解在20mL的蒸馏水中，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失；再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后，得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
[0010]3)N
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羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN
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羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
[0011]4)标记物的制备：包括胶体金、荧光微球和量子点的制备；
[0012]5)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联，交联结束，将所得的氧化锌
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壳聚糖
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胶体金或荧光微球或量子点洗涤，真空干燥24h；
[0013](b)氧化锌
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壳聚糖
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标记物交联标记抗体：取1ml氧化锌
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壳聚糖
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胶体金或荧光微球或量子点悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声20
‑
40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
[0014](c)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF
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15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
[0015](d)将预处理的样品垫、步骤(b)制备的氧化锌
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壳聚糖
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标记物标记抗体的玻璃纤维膜、步骤(c)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试纸条，最后将检测试纸条装入塑料外壳。
[0016]本专利技术所述步骤(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备中，1)N
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羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000
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12000g/mol。
[0017]本专利技术所述步骤(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
[0018]本专利技术所述步骤(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备中，3)N
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羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N
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羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
[0019]本专利技术所述步骤(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备中，4)标记物的制备包括胶体金的制备：将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm，纯化水液面形成漩涡，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备1)N
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羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10
‑
12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N
‑
羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·
2H2O溶解在20mL的蒸馏水中，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失；再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后，得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；3)N
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羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN
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羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。4)标记物的制备：包括胶体金、荧光微球和量子点的制备；5)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联，交联结束，将所得的氧化锌
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壳聚糖
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胶体金或荧光微球或量子点洗涤，真空干燥24h；(b)氧化锌
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壳聚糖
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标记物交联标记抗体：取1ml氧化锌
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壳聚糖
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胶体金或荧光微球或量子点悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声20
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40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；(c)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF
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15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；(d)将预处理的样品垫、步骤(b)制备的氧化锌
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壳聚糖
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标记物标记抗体的玻璃纤维膜、步骤(c)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试纸条，最后将检测试纸条装入塑料外壳。2.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌
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壳聚糖
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标记物制备中，1)N
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羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为80...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪波，
申请(专利权)人：吉林迅准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：