一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法。所述免疫侧流试纸条及其制备方法包括以下步骤：1）制备特异性纳米探针，并在结合垫上包被纳米探针；2）制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子@Au膜，并在膜上依次包被检测线T线和质控C线；3）将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条本发明专利技术的试纸条对待测物特异性高，灵敏度好，检测限低，可快速准确地检测出复杂样本中的待测物，有望成为适用于各种环境下快速、简便、特异、敏感的免疫检测试纸条。敏感的免疫检测试纸条。敏感的免疫检测试纸条。

【技术实现步骤摘要】
一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法


[0001]本专利技术属于检测
，涉及一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法。

技术介绍

[0002]试纸条技术因其操作简单、快捷、结果直观等优点被广泛应用于医学、环境监测等各个领域，其中传统免疫侧流试纸条凭借着快速、无需专业训练等优点适用于日常基层检测需求。传统免疫侧流试纸条的工作原理在于与待测物偶联的纳米探针在毛细管作用力下沿着硝酸纤维素膜(NC膜)向吸水垫方向移动，期间与喷涂在NC膜上的捕获抗体相结合而被固定在该区域，可显示出特定颜色从而直接判定结果。但是，传统免疫侧流试纸条的判定结果与颜色的深浅相关，仅能对待测物进行半定量，无法实现精确定量，影响分析结果的准确性。
[0003]表面增强拉曼技术(SERS)具有超灵敏的检测能力，特殊条件下可在单分子水平上进行表征，在生物医学应用领域具有巨大的潜力。迄今为止，已有大量研究将SERS技术与免疫试纸条结合检测各类待测物，大大提高了传统免疫试纸条的灵敏度，但是也存在一定的局限性，如复杂的生理样本、仪器波动等外界因素对拉曼信号的干扰，所以有必要对NC膜进行改进以提高检测结果的精确性和可靠性。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条及其制备方法，实现快速、灵敏、准确地检测复杂样本中的待测物。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条，包括以下步骤：
[0007]S1：制备特异性纳米探针
[0008]Au NPs以100:1(v/v)加入1mM的拉曼信号分子1，孵化2～2.1h后，以9500rpm离心10min去除多余的拉曼信号分子1；
[0009]以1:10(V
AgNO3
/V
Au NPs
)、1:10(V
AA
/V
Au NPs
)加入1mM的AgNO3和0.01M的抗坏血酸(AA)，反应30～35min，获得Au@拉曼信号分子1@Ag NPs溶液；
[0010]以1:1000(V
DSP
/V
Au NPs
)加入5mM的二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)，反应3～3.2h后加入一定量的具有生物识别功能的分子，在37℃下孵育1.5～1.6h后，以0.1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)重悬，封闭0.5～0.6h，得到特异性纳米探针溶液，置于4℃保存；
[0011]S2：制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子2@Au膜
[0012]将NC膜浸至10～50mM氨水溶液中1～1.2h后，转移至10～50mM三氟乙酸银溶液中，于65℃水浴条件下反应2～4h，得NC@Ag膜；将NC@Ag膜浸泡至0.1mM的拉曼信号分子2的PBS溶液中，孵育3～3.2h，得NC@Ag@拉曼信号分子2膜；接下来，将NC@Ag@拉曼信号分子2膜放置
于生长液中30～35min后，将0.1mM的氯金酸溶液(HAuCl4)以0.2ml/min加入其中，最后于37℃、250rpm下在摇床中反应4～4.2h，可得NC@拉曼信号分子2@Au膜；
[0013]S3：NC@拉曼信号分子2@Au膜包被检测T线和控制C线
[0014]使用划膜仪按照1μL/cm的用量在NC膜上划出T线、C线。
[0015]S4：结合垫包被特异性纳米探针
[0016]将结合垫浸泡至特异性纳米探针溶液中1～1.2h，于37℃鼓风烘箱中烘干；
[0017]S5：依次将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子2@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条
[0018]进一步地，所述拉曼信号分子1、拉曼信号分子2为4
‑
巯基苯甲酸(MBA)、2,3,5,6
‑
四氟
‑4‑
巯基苯甲酸(TFMBA)、亚甲基蓝(NBA)、4
‑
巯基苯硼酸(MPBA)等拉曼信号分子中的任意两种，且拉曼信号分子1、拉曼信号分子2具有不同拉曼特征峰。
[0019]进一步地，步骤S1中的特异性纳米探针溶液选用NaOH或K2CO3调节pH至最佳反应值。
[0020]进一步地，步骤S1中具有生物特异性识别功能的分子为抗体、抗原、适配体等中的任意一种。
[0021]进一步地，步骤S2中生长液的组成为：PVP(1mM)、AA(100mM)和NaOH(200mM)，三者体积比为5:0.75:0.75。
[0022]进一步地，步骤S3中T线和C线之间的距离为2mm。
[0023]本专利技术还提供了一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条检测实际样本的方法，包括以下步骤：
[0024]S1：利用上述免疫测流试纸条构建不同浓度的待测物与信号分子相对强度之间的标准工作曲线。
[0025]S2：在上述免疫测流试纸条的样品垫处滴入实际样本或将样品垫部分插入实际样本中，平放10～15min后观察结果。在可视化检测中，若T线和C线均显色，则实际样本中含有待测物(阳性)；若T线不显色，C线显色，则实际样本中不存在待测物(阴性)。随后，利用拉曼光谱仪器扫描T线处收集相应曲线，并根据标准工作曲线计算出待测物的浓度。
[0026]进一步地，所述实际样本的体积为50～100μL，优选70μL。
[0027]本专利技术中，基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条检测实际样本的工作原理为：当样品在该试纸条流动时，如果存在待测物，则被固定在结合垫上的特异性纳米探针结合；随着偶联样品继续沿着条带移动，待测物与T线上的识别分子再次结合，从而使得与待测物结合的特异性纳米探针截留在T线上，显示出检测橘红色线；如果样品不含待测物，则在测试区没有标记的复合物结合，也没有观察到线。剩余的特异性纳米探针沿着NC@拉曼信号分子2@Au膜移动到控制线区，C线捕获了多余的特异性纳米探针，表明流体已经通过NC@拉曼信号分子2@Au膜充分迁移。在进行所有有效检测期间，无论样本是否含有待测物，C线都会出现一条红紫色的线。最后，利用拉曼光谱仪器，可在T线上收集相应的拉曼光谱曲线。以NC@拉曼信号分子2@Au膜和特异性纳米探针上的特征峰强度比值构建了待测物的标准工作曲线，最终实现对实际样本中待测物的定量检测。
[0028]从以上技术方案可以看出，本专利技术的有益效果在于：以原位合成的方式在NC膜上修饰上具有内标的纳米粒子，信号强度均匀，且检测线上特异性捕获的纳米粒子也携带不
同的信号分子，因此可通过两者信号强度比率避免仪器等外界因素导致的信号波动，可极大程度地降低结果的假阳性或假阴性，提高检测结果的重现性、准确度和可靠性；另一方面，基于SERS灵敏度高以及双抗夹心法高特异性的优势，相较于传统免疫试纸条，本专利技术对复杂样本中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备特异性纳米探针，并在结合垫上包被纳米探针；2)制备修饰了拉曼信号分子的NC膜，即NC@拉曼信号分子@Au膜，并在膜上依次包被检测线T线和质控C线；3)将样品垫、结合垫、NC@拉曼信号分子@Au膜以及吸水垫按照顺序组装于PVC板上，得到免疫侧流试纸条。2.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1)中特异性纳米探针的制备过程为：在Au NPs中加入拉曼信号分子1，孵化2～2.1h后，离心去除多余的拉曼信号分子1，得到Au@拉曼信号分子1NPs溶液；将硝酸银溶液、抗坏血酸溶液依次加入Au@拉曼信号分子1NPs溶液中，反应30～35min，获得Au@拉曼信号分子1@Ag NPs溶液；加入二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯反应3～3.2h后，加入具有生物特异性识别功能的分子，然后后在37℃下孵育1.5～1.6h，以牛血清白蛋白重悬，封闭0.5～0.6h，得到特异性纳米探针溶液。3.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，所述特异性纳米探针溶液中加入NaOH或K2CO3调节pH至最佳反应值。4.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，所述具有生物特异性识别功能的分子为抗体、抗原、适配体中的任意一种。5.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术的具有自校准功能的免疫侧流试纸条的制备方法，其特征在于，步骤2)中NC@拉曼信号分子@Au膜的制备过程为：将NC膜浸至氨水溶液中1～1.2h后，转移至三氟乙酸银...

【专利技术属性】
技术研发人员：范敏，冯尚源，卢玉栋，彭仕润，赖舒霞，周启帆，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：