本发明专利技术涉及一种定量测定样本中核酸含量的方法，属于PCR检测技术领域。本发明专利技术提供了一种定量测定样本中核酸含量的方法，所述方法为在实时荧光定量PCR的基础上结合数字定量PCR，先用数字定量PCR辅助实时荧光定量PCR制备标准品，再用实时荧光定量PCR对测定样本中的待测核酸进行定量检测。所述方法以ddPCR绝对定量的拷贝数，可以校正qPCR中用于制作标准曲线的标准品浓度，进一步提高qPCR绝对定量的样本检测准确度；针对一些标准品的制作过程繁琐的样本检测，所述方法可以利用经dPCR绝对定量的样本直接作为标准品，进行其他样本的定量，保证了模板扩增基质的一致性，可以提高定量检测准确度。准确度。准确度。
【技术实现步骤摘要】
一种定量测定样本中核酸含量的方法
[0001]本专利技术涉及一种定量测定样本中核酸含量的方法，属于PCR检测
技术介绍
[0002]定量检测是致病微生物机理研究、病毒载量测定及免疫基因表达等的重要手段。目前，常见的定量检测技术主要包括实时荧光定量PCR(QuantitativeReal
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time PCR,qPCR)和数字PCR(digital PCR,dPCR)等。
[0003]其中，实时荧光定量PCR是一种先在核酸扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，然后通过内参或者外参法对待测样品中的特定核酸序列进行定量分析的定量检测技术。此技术能够实现待测样品中的特定核酸序列的大通量检测快速，但是，其需要用已知浓度的标准品去构建标准曲线，而在实际应用中，标准品的浓度一般使用紫外定量法测定，紫外定量法精度较低且误差较大，会导致标准品浓度产生偏差，进而严重影响使用此技术对待检样本进行定量检测的准确性。
[0004]数字PCR则是一种基于单分子PCR的对待测样品中的特定核酸序列进行定量分析的定量检测技术，其将模板随机分布于数万个纳升级微滴中，每个含有模板的微滴均是一个独立的PCR反应体系，可以实现不依赖标准曲线而对目标样本的绝对定量。与实时荧光定量PCR相比，此技术具有检测灵敏度高的优势，然而，其使用的数字PCR仪器价格昂贵，单反应成本较高，微滴发生器通量小，很难满足大批量检测。
[0005]因此，亟需找到一种集实时荧光定量PCR和数字PCR优势为一体的对待测样品中的特定核酸序列进行定量分析的定量检测技术，以克服现有实时荧光定量PCR和数字PCR存在的缺陷。
技术实现思路
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种定量测定样本中核酸含量的方法，所述核酸为DNA或RNA；当核酸为DNA时，所述方法包括如下步骤：
[0007]步骤一：提取待测样本的总DNA，得到DNA样本；
[0008]步骤二：将步骤一得到的DNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的DNA样本进行数字定量PCR检测，得到待测样本中待测核酸的DNA浓度；
[0009]步骤三：根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的DNA浓度，将待测样本进行梯度稀释，得到待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本；
[0010]步骤四：对步骤三得到的浓度呈梯度的DNA稀释样本进行实时荧光定量 PCR检测，得到与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值；
[0011]步骤五：以待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的DNA浓度为横坐标，以步骤五测得的与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的 Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0012]步骤六：将步骤一得到的DNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后，对步
骤一得到的DNA样本进行实时荧光定量PCR检测，得到DNA样本的Ct值，并将测得的Ct值带入步骤六绘制得到的标准曲线，得到测定样本中待测核酸的DNA浓度；
[0013]当核酸为RNA时，所述方法包括如下步骤：
[0014]步骤一：提取待测样本的总RNA，并对提取得到的总RNA进行逆转录，得到cDNA样本；
[0015]步骤二：将步骤一得到的cDNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的cDNA样本进行数字定量PCR检测，得到待测样本中待测核酸的RNA浓度；
[0016]步骤三：根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的RNA浓度，将待测样本进行梯度稀释，得到待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本；
[0017]步骤四：对步骤三得到的待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本进行逆转录，得到的浓度呈梯度的cDNA稀释样本；
[0018]步骤五：对步骤四得到的浓度呈梯度的cDNA稀释样本进行实时荧光定量 PCR检测，得到与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值；
[0019]步骤六：以待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的RNA浓度为横坐标，以步骤五测得的与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的 Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0020]步骤七：将步骤一得到的cDNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的cDNA样本进行实时荧光定量PCR检测，得到cDNA 样本的Ct值，并将测得的Ct值带入步骤六绘制得到的标准曲线，得到测定样本中待测核酸的RNA浓度；
[0021]所述数字定量PCR检测和实时荧光定量PCR检测所用上游引物、下游引物和探针以待测核酸为靶点。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述数字定量PCR检测的反应体系由10μL4
×
Probe PCR Master Mix、1.6μL浓度10μM的上游引物、1.6μL浓度10μM的下游引物、1μL浓度10μM的探针、5.8μL RNase
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free water和20μL cDNA样本模板组成。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述数字定量PCR检测的反应程序如下：
[0024]Hot：94℃3min；
[0025]40cycle：94℃12s，62℃30s，72℃30s。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系由2μL 10
×
PCR Buffer、0.2μL浓度10mM的dNTPs、2μL浓度25mM的MgCl2、 0.3μL浓度20μM的上游引物、0.3μL浓度20μM的下游引物、0.6μL浓度10μM 的探针、0.4μL 50
×
ROX、0.2μL Taq酶、4μL DEPC水和10μL cDNA稀释样本模板组成。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述实时荧光定量PCR检测的反应程序如下：
[0028]Hot：94℃3min；
[0029]40cycle：94℃12s，62℃30s，72℃30s。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述待测核酸为ACTB基因；所述上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13。
[0031]在本专利技术的一种实施方式中，所述逆转录的反应体系由5μL RNase
‑
freeddH2O、10μL 2
×
RT Mix、2μL HiScript II Enzyme Mix、1μL浓度50μM的 Oligo(dT)23VN、1μL浓度50ng/μL的Random hexamers、1μL总RNA模板组成。
[0032]在本专利技术的一种实施方式中，所述逆转录的反应程序如下：
[0033]26℃30min，42℃40min，85℃10min。
[0034]在本专利技术的一种实施方式中，所述标准曲线的线性公式为 y＝
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种定量测定样本中核酸含量的方法，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA；当核酸为DNA时，所述方法包括如下步骤：步骤一：提取待测样本的总DNA，得到DNA样本；步骤二：将步骤一得到的DNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的DNA样本进行数字定量PCR检测，得到待测样本中待测核酸的DNA浓度；步骤三：根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的DNA浓度，将待测样本进行梯度稀释，得到待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本；步骤四：对步骤三得到的浓度呈梯度的DNA稀释样本进行实时荧光定量PCR检测，得到与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值；步骤五：以待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的DNA浓度为横坐标，以步骤五测得的与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤六：将步骤一得到的DNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的DNA样本进行实时荧光定量PCR检测，得到DNA样本的Ct值，并将测得的Ct值带入步骤六绘制得到的标准曲线，得到测定样本中待测核酸的DNA浓度；当核酸为RNA时，所述方法包括如下步骤：步骤一：提取待测样本的总RNA，并对提取得到的总RNA进行逆转录，得到cDNA样本；步骤二：将步骤一得到的cDNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的cDNA样本进行数字定量PCR检测，得到待测样本中待测核酸的RNA浓度；步骤三：根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的RNA浓度，将待测样本进行梯度稀释，得到待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本；步骤四：对步骤三得到的待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本进行逆转录，得到的浓度呈梯度的cDNA稀释样本；步骤五：对步骤四得到的浓度呈梯度的cDNA稀释样本进行实时荧光定量PCR检测，得到与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值；步骤六：以待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的RNA浓度为横坐标，以步骤五测得的与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；步骤七：将步骤一得到的cDNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后，对步骤一得到的cDNA样本进行实时荧光定量PCR检测，得到cDNA样本的Ct值，并将测得的Ct值带入步骤六绘制得到的标准曲线，得到测定样本中待测核酸的RNA浓度；所述数字定量PCR检测和实时荧光定量PCR检测所用上游引物、下游引物和探针以待测核酸为靶点。2.如权利要求1所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶品彬，马静，张佩琢，
申请(专利权)人：苏州吉玛基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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