一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法技术

一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，包括：根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度，各个质粒标准品中含有对应微生物的目的基因。通过扩增产物的灰度值计算待测样品中的rRNA基因的拷贝数，进而计算得到待测样品中的待测微生物单元数，不用培养细胞，显著减少实验材料，缩短操作时间。通过PCR扩增产物的灰度值计算待测样品中的待测微生物目的基因的拷贝数浓度，进而计算得到待测样品中的待测微生物单元数浓度，不用培养细胞，显著减少实验材料，缩短操作时间。作时间。作时间。

【技术实现步骤摘要】
一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法


[0001]本专利技术涉及细胞计数领域，具体涉及一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法。

技术介绍

[0002]现有的细胞计数方法主要包括血球计数板计数法、图像法、各类手工计数等，这些方法都需要先对细胞进行培养，测定过程要求细胞悬浊液均匀，其过程比较漫长。血球计数板在显微镜下能直接读出每个小方格中的微生物的个体数目，根据该小格所占的体积，快速地推算出单位体积的溶液中含有的微生物总数。但需要准备的材料较多，若菌悬液中不加可以区分细胞死活的试剂时，计数通常计得的是活菌体和死菌体的总和，还有微小杂物也被计算在内，这样得出结果往往偏高，因此，该方法仅仅适用于体积较大的单细胞微生物的计数。细胞直接计数法虽然操作简单，但是耗费时间长，所需细胞量多。虽然市场上有各种类型的细胞计数仪，可以省去人工计数，但同样需要人工培养细胞，且有的仪器操作复杂。因此，目前用于细胞计数的方法不仅耗时费力，且会存在技术和仪器的误差。

技术实现思路

[0003]根据第一方面，一种实施例中提供一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，包括：根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度，各个质粒标准品中含有对应微生物的目的基因。
[0004]依据上述实施例的通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，通过PCR扩增产物的灰度值计算待测样品中的待测微生物目的基因的拷贝数浓度，进而计算得到待测样品中的待测微生物单元数浓度，不用培养细胞，显著减少实验材料，缩短操作时间。
附图说明
[0005]图1为一实施例的E.coil的PCR产物拍照成像图；
[0006]图2为一实施例的E.coil灰度值公式曲线图；
[0007]图3为一实施例的的B.fragilis的PCR产物拍照成像图；
[0008]图4为一实施例的B.fragilis灰度值公式曲线图。
具体实施方式
[0009]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申
请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0010]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0011]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0012]本文中，“质粒”是生物体中染色体或拟核以外的DNA分子。质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中(但酵母除外，酵母的2μm质粒存在于细胞核中)，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。
[0013]本文中，“rRNA”是指核糖体RNA。
[0014]本文中，“rRNA基因”是指编码核糖体RNA的基因，亦称rDNA，例如16S rRNA基因亦称16S rDNA，即为编码16S rRNA的基因。
[0015]本文中，“16S rRNA”即16S ribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。16S中的“S”是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。“16S rRNA基因”是指细菌上编码rRNA基因相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。
[0016]在一实施例中，本专利技术提供一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，包括：根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度，各个质粒标准品中含有对应微生物的目的基因。
[0017]拷贝数浓度是指单位体积(如每微升、每毫升、每升等等)的样品或质粒标准品试剂中的的核酸拷贝数，例如，待测样品中的目的基因拷贝数浓度可以是每微升待测样品中的目的基因拷贝数，即copies/μL；同理，对于质粒标准品，质粒标准品的拷贝数浓度可以是单位体积(如每微升、每毫升、每升等等)的质粒标准品试剂中质粒标准品的起始拷贝数，即copies/μL。
[0018]待测样品中待测微生物的单元数浓度是指单位体积(如每微升、每毫升、每升等等)的待测样品中待测微生物的单元数，可以是每微升待测样品中的单元数。例如，对于细胞型微生物，单元数浓度为细胞个数浓度，可以是个/μL；对于非细胞型微生物，单元数浓度则为拷贝数浓度，可以是copies/μL。
[0019]在一实施例中，在含有荧光试剂的PCR扩增反应体系中，分别对所述待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品进行PCR扩增反应，得到结合有所述荧光试剂的PCR扩增产物。
[0020]在一实施例中，所述荧光试剂选自SYTO
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82、SYTO
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9、SYTO
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13、SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreen中的至少一种。
[0021]在一实施例中，对各个PCR扩增产物进行拍照，获得待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值、各质粒标准品的PCR扩增产物的灰度值。
[0022]在一实施例中，待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品的PCR扩增反应体系及PCR扩增反应条件完全相同。
[0023]在一实施例中，PCR扩增反应体系中还含有热稳定的DNA聚合酶及其缓冲液、用于特异性扩增目的基因的引物。
[0024]在一实施例中，所述热稳定的DNA聚合酶选自Ex
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Taq酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶中的至少一种。缓冲液通常与热稳定的聚合酶配套使用。例如，采用的酶为Ex Taq酶时，缓冲液为Ex Taq Buffer，购买的酶与其缓冲液通常是配套的。
[0025]在一实施例中，PCR扩增反应体系中还含有dNTP。
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法，其特征在于，包括：根据待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值，以及不同浓度的质粒标准品的起始拷贝数浓度与各个质粒标准品的PCR扩增产物灰度值的函数关系，计算得到待测样品中待测微生物的单元数浓度，各个质粒标准品中含有对应微生物的目的基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在含有荧光试剂的PCR扩增反应体系中，分别对所述待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品进行PCR扩增反应，得到结合有所述荧光试剂的PCR扩增产物。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光试剂选自SYTO
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82、SYTO
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9、SYTO
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13、SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreen中的至少一种。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对各个PCR扩增产物进行拍照，获得待测样品中待测微生物的核酸的目的基因PCR扩增产物的灰度值、各质粒标准品的PCR扩增产物的灰度值；和/或，待测样品中待测微生物的核酸、各质粒标准品的PCR扩增体系及PCR扩增反应条件完全相同；和/或，PCR扩增反应体系中还含有热稳定的DNA聚合酶及其缓冲液、用于特异性扩增目的基因的引物；和/或，所述热稳定的DNA聚合酶选自Ex
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Taq酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶中的至少一种；和/或，PCR扩增反应体系中还含有dNTP。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应的循环数≥20；和/或，PCR扩增反应的循环数为23
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40；和/或，每个循环反应如下：94
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95℃，5
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30s；60
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65℃，5
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30s；和/或，PCR扩增反应还包括在循环反应之前进行预变性；和/或，预变性步骤的温度为94
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95℃，时间为1
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5min。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸、质粒标准品均为DNA分子；和/或，所述核酸为提取自待测微生物的DNA分子；和/或，所述核酸为由提取自待测微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝丽，孙相鑫，
申请(专利权)人：壹宏深圳基因有限公司，
类型：发明
国别省市：