一种检测HIV基因组拷贝数的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本发明专利技术还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。本申请的方法克服了数字PCR存在不稳定结果的问题，能够对数字PCR进行质量控制。能够对数字PCR进行质量控制。能够对数字PCR进行质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种检测HIV基因组拷贝数的方法


[0001]本专利技术涉及生物学，具体涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本专利技术还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。

技术介绍

[0002]治愈HIV的主要障碍是病毒在血液和不同解剖部位建立稳定的持续感染细胞库。这些库长期存在，可以大致分为两种。在“潜伏库”中，细胞携带着一个完整的病毒基因组，该基因组不表达病毒转录本或蛋白质。这些潜伏的原病毒不受ART影响，也不被免疫系统清除；然而，在刺激后，它们可以恢复到病毒生产状态。目前消除潜伏库的方法就是逆转病毒的潜伏期，从而消除受感染的细胞，这种方法被称为“震杀”。除了潜伏库，“活性库”是一群转录活性细胞，产生HIV
‑
1相关的RNA、蛋白质和可能的病毒粒子，这些可以在艾滋病毒感染者(PWH)中检测到。消除这两种病毒储存库是实现功能性治愈的重点，测量病毒储存库的大小是消除病毒储存库的前提。
[0003]HIV
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1在活化的CD4+T细胞中复制良好，潜伏感染被认为只发生在静止的CD4+T细胞。当受感染的CD4+淋巴细胞在HIV
‑
1的细胞病变作用下存活，逃避免疫系统并携带完整的前病毒返回到静息记忆状态时，就可能形成一个稳定的病毒储存库。由于记忆细胞的生物学功能是持续很长一段时间，以允许对先前遇到过的抗原再刺激作出反应，而且由于这些细胞中的病毒DNA是稳定整合的，这些潜伏感染的记忆细胞会成为HIV
‑
1的长期病毒储存库。目前，已有人通过测量HIV
‑
1病毒的DNA含量来测量病毒储存库的大小并提供了解释，而且当细胞数量有限时，由于其他方法对定量测量不够敏感，测量HIV
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1病毒的DNA含量可能是唯一的化验方法。因为整合后潜伏期被认为是病毒持续存在的主要形式，所以整合HIV
‑
1DNA的含量水平会提供比较准确的病毒库大小的测量结果。
[0004]然而，当前可用的数字PCR平台都会受到假阳性分区的影响(Bosman KJ,Nijhuis M,van Ham PM,Wensing AMJ,Vervisch K,Vandekerckhove L,et al.Comparison of digital PCR platforms and semi
‑
nested qPCR as a tool to determine the size of the HIV reservoir.Sci Rep.2015；5:13811.)，例如在国外研究者的一次HIV
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1RNA检测中，每3孔阴性对照中就有1孔有2～3个阳性液滴。当检测HIV
‑
1DNA含量更低的样本时，这种影响会更大，比如PBMCs、全血、干血点或组织活检。并且，在该文献中还提到，假阳性会导致将待测样本确认为HIV感染样本的错误结果，并继续进行ART(抗反转录病毒治疗)，如果意欲区分待测样本中是否存在HIV DNA，则不建议使用数字PCR。
[0005]因此，为了解决上述问题，本申请意在提供一种能够利用数字PCR稳定、准确检测HIV
‑
1基因组拷贝数的方法。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，解决了数字PCR中存在的结果不稳定问题。分别对细胞计数和数字PCR的检测结果进行相关性分析，获得了准确的检测结果。
[0007]因此，在第一方面，本申请提供了一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法：
[0008](a)提供含有单拷贝HIV基因组的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的核酸以及待测样品中的核酸，将所述细胞中的核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的核酸称为第二核酸；
[0009](b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；
[0010](c)对所述细胞进行计数；
[0011](d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为HIV的拷贝数。
[0012]在本文中，含有单拷贝HIV基因组的细胞不仅包括单个的体细胞，体细胞群，分离的单个血细胞或血细胞群，还包括各种人工制备或工业构建的细胞。
[0013]在第二方面，本申请提供了一种数字PCR检测结果的评价方法：
[0014](a)提供含有单拷贝靶核酸的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的靶核酸以及待测样品中的靶核酸，将所述细胞中的靶核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的靶核酸称为第二核酸；
[0015](b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；
[0016](c)对所述细胞进行计数；
[0017](d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，表明该数字PCR检测结果准确，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品中靶核酸的拷贝数。
[0018]在本文中，含有单拷贝靶核酸的细胞不仅包括单个的体细胞，体细胞群，分离的单个血细胞或血细胞群，还包括各种人工制备或工业构建的细胞。
[0019]在某些实施方案中，所述细胞选自8E5，J
‑
lat6.3，J
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lat8.4，J
‑
lat9.2，J
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lat15.4，J
‑
lat5A8中的任意一种或几种。在某些实施方案中，所述细胞为8E5细胞。
[0020]在某些实施方案中，待测样品选自细胞(例如，离体的体细胞或体细胞群，分离的血细胞或血细胞群)，血浆，血清，全血中的一种或多种。
[0021]在某些实施方案中，所述待测样品获自哺乳动物(例如，人)。
[0022]在某些实施方案中，第一核酸包括DNA和/或RNA。
[0023]在某些实施方案中，第二核酸包括DNA和/或RNA。
[0024]在某些实施方案中，当所述比值处于0.8至1.2的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数。在某些实施方案中，当所述比值处于0.9至1.1的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数。
[0025]在某些实施方案中，所述数字PCR选自微滴式数字PCR或芯片式数字PCR。
[0026]在某些实施方案中，所述HIV为HIV
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1和/或HIV
‑
2。
[0027]在某些实施方案中，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法：(a)提供含有单拷贝HIV基因组的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的核酸以及待测样品中的核酸，将所述细胞中的核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的核酸称为第二核酸；(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；(c)对所述细胞进行计数；(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为HIV的拷贝数。2.一种数字PCR检测结果的评价方法：(a)提供含有单拷贝靶核酸的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的靶核酸以及待测样品中的靶核酸，将所述细胞中的靶核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的靶核酸称为第二核酸；(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；(c)对所述细胞进行计数；(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，表明该数字PCR检测结果准确，获得的第二核酸的拷贝数即为靶核酸的拷贝数。3.权利要求1或2的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个特征：(1)所述细胞选自8E5，J
‑
lat6.3，J
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lat8.4，J
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lat9.2，J
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lat15.4，J
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lat5A8中的任意一种或几种；优选地，所述细胞为8E5细胞；(2)待测样品选自细胞(例如，离体的体细胞或体细胞群，分离的血细胞或血细胞群)，血浆，血清，全血中的一种或多种；(3)所述待测样品获自哺乳动物(例如，人)；(4)第一核酸包括DNA和/或RNA；(5)第二核酸包括DNA和/或RNA；(6)当所述比值处于0.8至1.2的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数；优选地，当所述比值处于0.9至1.1的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为待测样品的拷贝数；(7)所述数字PCR选自微滴式数字PCR或芯片式数字PCR；(8)所述HIV为HIV
‑
1和/或HIV
‑
2。4.权利要求1
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3任一项所述的方法，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一个检测探针，所述检测探针包含特异性杂交于所述HIV基因组的核苷酸序列并且能够与所述核酸中的HIV基因组的区域退火或杂交，并且，所述检测探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，所述检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)针对第一核酸提供第一探针，针对第二核酸提供第二探针，且第一探针与第二探针不相同或者相同；
(2)所述检测探针各自独立地包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(PNA)或锁核酸)，或其任何组合组成；(3)所述检测探针各自独立地为自淬灭探针；例如，所述检测探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述报告基团和淬灭基团相距10
‑
80nt或更长的距离；(4)所述检测探针中的报告基团各自独立地为荧光基团(例如，ALEX
‑
350,FAM,VIC,TET,CAL Fluor Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)；并且，淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ
‑
1或者BHQ
‑
2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；(5)所述检测探针各自独立地不具有或者具有抵抗核酸酶活性(例如5'核酸酶活性，例如5'至3'核酸外切酶活性)的抗性；例如，所述检测探针的主链不包含或者包含抵抗核酸酶活性的修饰，例如硫代磷酸酯键，烷基磷酸三酯键，芳基磷酸三酯键，烷基膦酸酯键，芳基膦酸酯键，氢化磷酸酯键，烷基氨基磷酸酯键，芳基氨基磷酸酯键，2'
‑
O
‑
氨基丙基修饰，2'
‑
O
‑
烷基修饰，2'
‑
O
‑
烯丙基修饰，2'
‑
O
‑
丁基修饰，和1
‑
(4'
‑
硫代
‑
PD
‑
呋喃核糖基)修饰；(6)所述检测探针各自独立地是线性的，或者具有发夹结构；(7)所述检测探针各自独立地具有相同或不同的报告基团；优选地，所述检测探针具有相同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；或，所述检测探针具有不同的报告基团，并且，对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析，然后根据报告基团的信号种类及熔解曲线中的熔解峰来确定靶核酸的存在；(8)所述检测探针各自独立地具有3'
‑
OH末端；或者，所述检测探针的3'
‑
末端是封闭的；例如，通过在检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH上添加化学部分(例如，生物素或烷基)，通过将检测探针的最后一个核苷酸的3'
‑
OH去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭检测探针的3'
‑
末端；(9)所述检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。5.权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中，针对每一种核酸中的HIV基因组，还提供至少一对能够扩增所述HIV基因组的引物组；优选地，所述引物组包含至少一条正向引物和/或至少一条反向引物；更优选地，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：(1)针对第一核酸提供第一引物组，针对第二核酸提供第二引物组，且第一引物组与第二引物组不相同或者相同；(2)所述正向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(3)所述反向引物或其任何组成成分包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸，或其任何组合组成；(4)所述引物组的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄维金，王佑春，赵晨燕，周泽华，张新禹，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：