一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法及系统技术方案

一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法，包括：在含有病原核酸序列和人源核酸序列的待测血浆中添加已知含量的内参序列；从添加有内参序列的待测血浆中提取游离DNA，并对所述游离DNA进行文库构建、上机测序及生物信息学分析，得到包含内参特异检出序列、病原特异检出序列及人源特异检出序列的总测序数据；统计出内参特异检出RPM值及病原特异检出RPM值；通过理论模型计算出待测血浆中细菌核酸浓度，提出以每毫升血浆中的微生物特异cfDNA拷贝数作为检测信号值，对病原体的真实载量进行评估。本发明专利技术提供了一种实现上述检测方法的系统。本发明专利技术具有高效快速、操作简便、高灵敏度、高精密度、高准确性的优点。高准确性的优点。高准确性的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法及系统


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及核酸的检测方法，具体来说是一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法及系统。

技术介绍

[0002]宏基因组下一代测序(metagenomic next
‑
generation sequencing，mNGS)可直接对临床标本进行无预先假设、独立于培养的病原体检测，尤其是复杂感染性疾病中少见、新发或不典型的病原体。在过去十年中，基于快速、友好型数据分析工具以及准确、全面数据库的建立，测序仪器的激增及测序成本的指数级下降，使mNGS技术能够跨越从微生物研究到诊断微生物学的鸿沟，推动其在微生物学实验室及预防感染措施的广泛应用。
[0003]结合液体活检的无创性及易获得性以及微生物基因组数据库的可用性，基于mNGS的血浆微生物游离DNA(microbial cell
‑
free DNA，mcfDNA)测序在改善疾病的诊断和治疗方面具有前所未有的潜力。1948年，Mandel和Metais第一次报道了来自人体细胞释放到体液中的cfDNA。在不同健康个体中，血浆cfDNA含量差异较大，通常为0
‑
100纳克/毫升，有时超过1500纳克/毫升。在感染性疾病状态下，血浆cfDNA含量明显增加。cfDNA来源于核基因组、线粒体基因组和微生物基因组。其中人类DNA占比超过90％，甚至超过99％，而微生物游离DNA只占一小部分。进一步的研究表明，mcfDNA的半衰期仅几分钟，主要通过肝脏清除，短于nuDNA(10
‑
15分钟)。
[0004]血浆中的mcfDNA主要有两种来源：1)微生物菌体进入血液。由于全身系统性感染，血液循环系统中存在微生物，或者局部感染时，微生物可能短暂侵入血液循环系统，导致一过性的菌血症。这些入侵微生物会被宿主免疫系统及抗感染药物杀灭，导致微生物DNA释放到循环中，在核酸外切酶的存在下形成称为mcfDNA的小片段；2)核酸片段进入血液。病原体感染人体细胞，导致人体细胞凋亡，将微生物核酸片段释放到血液循环系统中，或当血液供应丰富的器官发生局部感染时，巨噬细胞发挥免疫作用，吞噬病原体后细胞凋亡，释放微生物核酸片段。
[0005]血浆mcfDNA由于其非侵入性和可获得性，已被用作广泛病原体感染的生物标志物。研究证明，血浆mcfDNA测序的灵敏度显著高于血培养。然而，血浆mcfDNA测序的临床应用仍面临着前所未有的挑战。由于人类基因组远大于微生物基因组(比细菌基因组大1000倍)，且宿主DNA含量的个体差异较大，检出序列数很难反映病原的真实含量，对于判断检出的可靠性以及监控病原载量较为困难。鉴于目前的湿试验去宿主策略可能导致某些病原核酸漏检，拟寻找更有效的方法以评估病原的真实载量。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法和系统，所述的这种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法和
系统要解决现有技术中血浆微生物的检测中检出序列数很难反映病原的真实含量、可能导致某些病原核酸漏检的技术问题。
[0007]本专利技术提供了一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法，包括如下步骤：
[0008]1)在含有病原核酸序列和人源核酸序列的待测血浆中添加已知含量的内参序列；
[0009]2)从添加有内参序列的待测血浆中提取游离DNA，并对上述游离DNA进行文库构建、上机测序及生物信息学分析，得到包含内参特异检出序列、病原特异检出序列及人源特异检出序列的总测序数据；
[0010]3)从上述测序数据统计出内参特异检出RPM值及病原特异检出RPM值，所述的内参特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到该内标上的序列数，所述的病原特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到某微生物基因组上的序列数；
[0011]4)通过如下理论模型计算出待测血浆中细菌核酸浓度，提出以每毫升血浆中的微生物特异cfDNA拷贝数(copies ofmicrobe
‑
specific cfDNA per milliliter ofplasma，CPM)作为检测信号值，对病原体的真实载量进行评估：
[0012]非肠杆菌科细菌：Log
10
(病原特异检出RPM值/内参特异检出RPM值)＝1.132(Log
10
待测病原核酸浓度)
‑
5.910；
[0013]肠杆菌科细菌：Log
10
(病原特异检出RPM值/内参特异检出RPM值)＝1.242(Log
10
待测病原核酸浓度)
‑
6.730。
[0014]进一步的，步骤1)中，上述内参序列是人工设计，其序列不属于任何已知的生物核酸序列，且与病原核酸序列和人源核酸序列均不存在交叉序列。
[0015]进一步的，所述内参序列是通过随机序列生成器模拟生成随机序列，然后将生成的随机序列与微生物基因组数据库及人源基因组数据库进行比对分析，从而得到未比对到上述微生物基因组数据库及人源基因组数据库的序列。
[0016]进一步的，所述内参序列的筛选需要考虑片段长度及GC含量对mNGS灵敏度的影响。
[0017]进一步的，所述内参序列的片段长度为150
‑
250bp，最优为188bp；GC含量为45
‑
60％，最优为53.72％。
[0018]进一步的，所述内参序列在待测血浆中的含量，是根据内参特异检出RPM值与人源核酸背景的相关性而确定的内标添加量，该添加量保证在不同血浆人源核酸背景下内参序列都能被稳定检出，且不影响病原检出的灵敏度。
[0019]进一步的，所述内参序列在待测血浆中的添加量为108‑
109copies/mL，最优为109copies/mL。
[0020]进一步的，所述待测血浆中细菌核酸浓度的理论模型包括非肠杆菌科细菌及肠杆菌科细菌两种。
[0021]本专利技术还提供了实现上述一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的生信分析系统，包括：
[0022]测序数据分析单元，用于分析待测血浆的全部测序数据，上述待测血浆中含有病原核酸序列和人源核酸序列，且含有已知含量的内参序列，上述测序数据包含内参特异检出序列、病原特异检出序列及人源特异检出序列；
[0023]测序数据统计单元，用于从上述测序数据统计出内参特异检出RPM值及病原特异检出RPM值，所述的内参特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到该内标上的序列数，所述的病原特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到某微生物基因组上的序列数；
[0024]病原核酸计算单元，通过如下理论模型计算出待测血浆中细菌核酸浓度，提出以CPM作为检测信号值，对病原体的真实载量进行评估：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于内参进行血浆微生物游离DNA宏基因组定量检测的方法，其特征在于包括如下步骤：1）在含有病原核酸序列和人源核酸序列的待测血浆中添加已知含量的内参序列；2）从添加有内参序列的待测血浆中提取游离DNA，并对上述游离DNA进行文库构建、上机测序及生物信息学分析，得到包含内参特异检出序列、病原特异检出序列及人源特异检出序列的总测序数据；3）从上述测序数据统计出内参特异检出RPM值及病原特异检出RPM值，所述的内参特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到该内标上的序列数，所述的病原特异检出RPM值为每百万测序序列中匹配到某微生物基因组上的序列数；4）通过如下理论模型计算出待测血浆中细菌核酸浓度，提出以每毫升血浆中的微生物特异cfDNA拷贝数作为检测信号值，对病原体的真实载量进行评估：非肠杆菌科细菌：Log
10
（病原特异检出RPM值/内参特异检出RPM值）=1.132（Log
10
待测病原核酸浓度）
‑ꢀ
5.910；肠杆菌科细菌：Log
10
（病原特异检出RPM值/内参特异检出RPM值）=1.242（Log
10
待测病原核酸浓度）
‑ꢀ
6.730。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，上述内参序列是人工设计，其序列不属于任何已知的生物核酸序列，且与病原核酸序列和人源核酸序列均不存在交叉序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参序列是通过随机序列生成器模拟生成随机序列，然后将生成的随机序列与微生物基因组数据库及人源基因组数据库进行比对分析，从而得到未比对到上述微生物基因组数据库及人源基因组数据库的序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参序列的筛选需要考虑片段长度及GC含量对mNGS灵敏度的影响。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内参序列的片段长度为150
‑
250 bp，最优为188 bp；GC含量为45
‑
6...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文娟，王莉莉，王珺，韩序，王计超，温冬华，田文杰，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：