本发明专利技术公开一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)根据需要检测的目标基因或DNA序列设计2条识别突变端的gDNA和2条识别非突变端的gDNA，均为16～19nt；(2)利用设计的4条gDNA和Tth Ago酶对目标基因或DNA片段进行剪切；(3)针对目标基因或DNA片段上Tth Ago酶两端剪切位点之间的45～65bp序列设计恒温扩增的引物，并进行PCR恒温扩增；(4)根据恒温扩增反应过程中待测样品相对野生型样品的Ct值来判断待测样品中是否存在单碱基突变。本发明专利技术方法步骤简便，操作简单，具有高特异性、高灵敏性，可用于低丰度单碱基突变的检测。低丰度单碱基突变的检测。低丰度单碱基突变的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用
[0001]本专利技术属于基因突变检测
，特别涉及一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用。
技术介绍
[0002]单核苷酸变异是指在DNA特定位置发生一个核苷酸的改变，广泛存在于生物体遗传信息的编码中，当较少出现的等位基因频率大于或等于1％时，则称为单核苷酸多态性。对点突变的研究有助于深入认识高等生物的遗传特性，解释个体的表型差异，揭示基因和蛋白质的正常功能，变异的成因以及不同个体对环境变化的响应机制，对功能基因组学研究和建立分子标记都具有重要意义。稀有多态性等位基因的检测对于多种肿瘤的早期诊断和监测越来越重要，因此在复杂的脱氧核糖核酸分子混合物中检测极其罕见的变异等位基因已经引起了越来越多的关注，主要目的是解决与精确单核苷酸分辨和简化多重检测技术相关的问题，特别是用于检测患者中与癌症相关的脱氧核糖核酸生物标志物。随着基因组测序工作的开展，点突变的检测和筛选正成为人们关注的焦点，检测方法也随之迅速发展；此外，当点突变所造成的基因理化特性改变比较微弱时，点突变的检测就变得非常困难，这推动着人们从多方面探索和建立新的检测方法。
[0003]限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR
‑
RFLP)是最早用于分析已知点突变的方法。如果点突变正好发生在某种限制性内切酶的识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用PCR特异扩增的这段DNA经某一限制酶消化后，再通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，即可确定是否存在点突变。这种检测具有较高的特异性，重复性好，但仅适于涉及到特定限制性内切酶识别位点的突变检测和突变频率大于1％的多态性检测；另外，该方法也不能确定是哪种碱基的突变。在过去的几年里，新的核酸编辑方法和聚合酶链反应程序也被探索出来。然而，这些方法在检测灵敏度、成本、时间和简单性方面都令人不满意。例如常规的PCR，不能检测到单碱基突变。突变扩增阻滞系统(ARMS)方法使突变碱基序列包含在引物序列中，可以选择性扩增变体序列，但不能确定或者验证突变的等位基因。其他方法，如阻断剂置换扩增和低温共扩增，需要严格要求靶的退火温度。限制性内切酶介导的选择性聚合酶链反应分析允许同时扩增突变信号和抑制野生型基因扩增，但受限于热稳定限制性酶的种类。数字PCR方法是目前最先进的单碱基突变分析技术，可以实现0.01％单碱基突变率时的检测，与传统方法相比具有多种优势，不足的是，数字PCR设备的高成本阻碍了这种方法的广泛应用。
[0004]具有序列特异性剪切能力的核酸内切酶是识别核酸靶标和后续检测设计的有力工具。近年来，研究人员已经从古生菌和细菌中鉴定出各种核酸内切酶，它们可以被小片段核酸引导来切割互补双链，其中CRISPR
‑
Cas作为基因组编辑工具已经引起了相当大的关注，但它的应用一直受到很大的限制，原因之一是它对PAM识别位点的依赖，而PAM在许多已报道的生物基因序列中都不存在。与CRISPR
‑
Cas类似，Argonaute(Ago)蛋白也是小片段核
酸引导的核酸内切酶。但是与Cas核酸酶不同的是，Ago核酸酶不需要存在PAM序列的识别位点，因此用途更广泛。在适当的条件下，由与目标DNA或RNA互补的小片段核酸(gDNA)来引导，实现Ago核酸酶对目标DNA或RNA的剪切。
[0005]来自嗜热菌(Thermus thermophiles，Tth)的Ago酶的结构包括N
‑
末端、L1、PAZ、L2、MID和PIWI六个结构域，在PIWI结构域中具有催化性四分体DEDX(X是D、H或K)，能够结合参与剪切催化的二价金属离子，当用gDNA进行引导时，Tth Ago酶能够剪切gDNA的第10和第11位之间(g10/g11)的互补靶。虽然Mg
2+
作为激活Tth Ago酶活性的催化剂，但催化剪切双链效果并不是十分理想。
[0006]聚合酶链式反应(PCR)的发展为核酸扩增提供了强有力的工具，微量的核酸靶标可以通过PCR成倍放大。然而，基于PCR的技术大部分需要电动的热循环设备来重复地加热和冷却，这限制了它们在实验室以外的环境中的应用。等温核酸扩增方法的出现克服了传统PCR的局限性，提供了在不需要热循环设备的情况下进行核酸扩增的可能。另外，生物信息分析的未来需求之一就是开发简单、灵敏和可靠的核酸等温扩增方法，可用于偏远或边远地区和发展中国家的新发传染病的检测。核酸的链交换反应(SEA)是活体进行遗传同源重组、DNA复制和DNA修复的关键自然过程。dsDNA每个碱基对之间的相互作用力比较弱，允许瞬间开放，从而能够造成碱基对在一定温度下间歇性断裂，导致DNA产生单链变性气泡。由于DNA的这种现象，SEA可以在没有基因重组酶的辅助下进行DNA复制。
[0007]针对每一种单碱基突变其位置的确定，剪切下来需扩增核酸片段长度的固定(45～65bp)以及要求从剪切下来核酸片段两端的顶端进行等温扩增的要求，决定了对该核酸片段进行扩增时引物设计序列的固定化，因此，会产生较高的非特异性扩增。又由于SEA所要求引物扩增的特异性较高，故有必要去找到合适的方法以降低非特异性扩增，增加SEA的扩增效率。
技术实现思路
[0008]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供所述利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法的应用。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，包括如下步骤：
[0012](1)设计4条gDNA
[0013]根据需要检测的目标基因或DNA片段的序列分别设计2条16～19nt的识别突变端的gDNA(引导DNA)和2条16～19nt的识别非突变端的gDNA；其中，所述的识别突变端的gDNA和识别非突变端的gDNA的5
’
端的第一位碱基均为T，且碱基T被磷酸基团修饰；所述的识别突变端的gDNA除第一个磷酸化的T碱基外，其余序列与目标基因的突变型基因序列互补，并与目标基因的野生型基因序列形成单碱基错配；所述的识别非突变端的gDNA除第一个磷酸化的T碱基外，其余序列与突变端gDNA剪切位点的上游或下游45～65bp处的序列互补；所述的4条gDNA序列不同；
[0014](2)Tth Ago酶剪切
[0015]将Tth Ago酶、步骤(1)中设计的2条识别突变端的gDNA和2条识别非突变端的gDNA分别在缓冲体系中孵育15～30分钟，孵育完成之后将其混合在一起，然后加入含目标基因或DNA片段的待测样品，在66～90℃条件下进行Tth Ago酶剪切反应，同时以含目标基因或DNA片段的野生型基因为对照样品，反应得到待测样品的酶切产物以及对照样品的酶切产物；其中，所述的缓冲体系为含Mg
2+
和Mn
2+...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计4条gDNA根据需要检测的目标基因或DNA片段的序列分别设计2条16～19nt的识别突变端的gDNA和2条16～19nt的识别非突变端的gDNA；其中，所述的识别突变端的gDNA和识别非突变端的gDNA的5
’
端的第一位碱基均为T，且碱基T被磷酸基团修饰；所述的识别突变端的gDNA除第一个磷酸化的T碱基外，其余序列与目标基因的突变型基因序列互补，并与目标基因的野生型基因序列形成单碱基错配；所述的识别非突变端的gDNA除第一个磷酸化的T碱基外，其余序列与突变端gDNA剪切位点的上游或下游45～65bp处的序列互补；所述的4条gDNA序列不同；(2)Tth Ago酶剪切将Tth Ago酶、步骤(1)中设计的2条识别突变端的gDNA和2条识别非突变端的gDNA分别在缓冲体系中孵育15～30分钟，孵育完成之后将其混合在一起，然后加入含目标基因或DNA片段的待测样品，在66～90℃条件下进行Tth Ago酶剪切反应，同时以含目标基因或DNA片段的野生型基因为对照样品，反应得到待测样品的酶切产物以及对照样品的酶切产物；其中，所述的缓冲体系为含Mg
2+
和Mn
2+
中的至少一种的缓冲体系；(3)荧光定量PCR
①
设计PCR恒温扩增引物根据突变端和非突变端gDNA引导的Tth Ago酶在目标基因或DNA片段上的两端剪切位点之间的45～65bp DNA片段序列设计一对长度为20～25nt、且满足从该45～65bp的DNA片段两端的顶端开始扩增的PCR恒温扩增引物；
②
PCR恒温扩增将步骤(2)中得到的待测样品的酶切产物以及对照样品的酶切产物先经过核酸外切酶处理，然后分别加入到含有DNA聚合酶，PEG 200和甜菜碱的反应体系中，利用步骤
①
中设计的PCR恒温扩增引物进行荧光定量PCR恒温扩增，分别获取反应体系在反应过程中的实时荧光曲线，并以此判断目标基因的待测样品中是否存在单碱基突变；(4)判断：若对照样品在反应过程中获取的实时荧光曲线随着时间的变化一直趋于平稳或其Ct值低于待测样品的Ct值，且待测样品在反应过程中获取的实时荧光曲线随着时间的延长存在指数扩增的过程，说明该待测样品存在单碱基突变；若待测样品在反应过程中获取的实时荧光曲线随时间变化与对照样品一致，说明该待测样品不存在单碱基突变。2.根据权利要求1所述的利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的识别突变端的gDNA与野生型目标基因或DNA片段的错配位点位于gDNA与目标基因互补序列的第9位、第10位、第11位或第15位。3.根据权利要求2所述的利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的识别突变端的gDNA与野生型目标基因或DNA片段的错配位点位于gDNA与目标基因互补序列的第10位。4.根据权利要求1所述的利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征在
于：步骤(2)中所述的缓冲体系中4条gDNA的摩尔比为1:1:1:1，且4条gDNA的总摩尔与Tth Ago酶的摩尔比为5～10:1；步骤(3)中所述的DNA聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，利用其进行恒温扩增反应的温度低于步骤(2)中剪切下来的45～65bp DNA片段的Tm值。5.根据权利要求1所述的利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：常好才，朱梦媛，欧阳雯雯，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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