分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法技术

本发明专利技术提供了一种分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法。具体地，本发明专利技术采用双重荧光定量PCR方法，检测慢病毒载体系统中含目的基因转移质粒上的包装序列Psi和宿主细胞中单拷贝基因，计算得到样本中目的基因拷贝数/细胞。此方法具有广泛的通用性，避免了针对不同目的基因设计相应的引物及探针的麻烦，大大缩短研究开发的时间，并且适用目前第一代到第三代所有的HIV

【技术实现步骤摘要】
分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法


[0001]本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及一种通用型的以慢病毒载体为介导的目的基因拷贝数的分析检测方法。

技术介绍

[0002]慢病毒载体(lentiviral vector)作为外源基因转移的工具在科研和临床研究领域发挥越来越重要的作用。相较于传统的质粒转染方式，慢病毒载体具有感染方便，阳性率高，病毒基因组会插入宿主基因组中，所以筛选克隆成功率高等诸多优点。
[0003]在基因治疗领域，筛选得到的阳性克隆细胞株，往往需要评价导入的目的基因拷贝数水平。目前常见的方法是通过荧光定量PCR方法，针对目标基因设计引物，制备参考质粒，按照宿主细胞的基因组大小估算每个细胞的拷贝数。目前发现该方法得到的结果不准确，结果可重复性差；同时针对不同的基因需要单独取开发方法，比较繁琐。
[0004]因此，本领域需要开发一种准确性高、通用性好的慢病毒载体目的基因拷贝数检测技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是提供一种分析和检测慢病毒载体介导的目的基因的拷贝数的方法。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种检测宿主细胞中目的基因拷贝数的方法，所述目的基因通过慢病毒载体导入，所述方法包括以下步骤：
[0007]1)检测细胞中Psi基因的拷贝数；
[0008]2)检测细胞中单拷贝基因的拷贝数；
[0009]3)按照以下公式计算细胞中目的基因的拷贝数：
[0010]目的基因拷贝数/细胞＝2
×
Psi拷贝数/单拷贝基因。
[0011]在一优选例中，所述方法是双重qPCR方法。
[0012]在一优选例中，所述Psi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]在一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞。
[0014]在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
[0015]在另一优选例中，所述宿主细胞选自以下来源的宿主细胞：大鼠、小鼠、犬、家兔、猫、牛、马、猴、人。
[0016]在另一优选例中，所述宿主细胞为人源细胞。
[0017]在另一优选例中，所述单拷贝基因选自下组：GAPDH、TERT、β
‑
ACTIN、β
‑
globin、RPPH1。
[0018]在另一优选例中，所述单拷贝基因是核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的端粒逆转录酶TERT基因。
[0019]在另一优选例中，所述慢病毒载体是第一代到第三代的HIV
‑
I慢病毒载体系统中
的任一种。
[0020]在一优选例中，所述方法包括以下步骤：
[0021]S1)提供待检测样品和设计的PCR反应体系，所述反应体系包含Psi基因的正向引物和反向引物、针对宿主细胞单拷贝基因的正向引物和反向引物、检测Psi基因的探针和所述检测宿主细胞单拷贝基因的探针；
[0022]S2)将所述的Psi基因和所述的宿主细胞单拷贝基因一同合成到质粒载体中，转化挑取单克隆，得到参考品，检测参考品质量浓度，并通过公式换算成拷贝数，所述公式为：
[0023]质粒拷贝数(copies/μl)＝6.02x10
14
×
质粒浓度(ng/μl)/(质粒碱基数
×
660)；
[0024]S3)将参考品进行梯度稀释，制成标准品，利用步骤S1)所述的反应体系，在适当的条件下，对标准品进行qPCR反应，根据每个标准品产生的Psi基因和宿主细胞单拷贝基因的Ct值与对应的拷贝数对数值绘制标准曲线；
[0025]S4)利用S1)所述的反应体系，在适当的条件下，对待检测样品进行qPCR反应，检测反应产物得到Psi基因和宿主细胞单拷贝基因的CT值；
[0026]S5)基于步骤S2)所述的标准曲线和步骤S4)所述的CT值，计算得到Psi基因和宿主细胞单拷贝基因的拷贝数，根据公式计算目的基因拷贝数/细胞，所述公式为：
[0027]目的基因拷贝数/细胞＝2
×
Psi拷贝数(copies/μl)/单拷贝基因数(copies/μl)；
[0028]其中，所述Psi基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0029]在另一优选例中，所述的单拷贝基因为TERT基因。
[0030]在另一优选例中，针对Psi基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、4所示；针对TERT基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、7所示。
[0031]在另一优选例中，所述检测所述Psi基因的探针如SEQ ID NO:5所示；所述检测所述TERT基因的探针如SEQ ID NO:8所示。
[0032]在另一优选例中，步骤S1)所述的反应体系还包括选自下组的一种或多种组分：
[0033](a)用于PCR扩增的缓冲液或缓冲组分；
[0034](b)用于PCR扩增的聚合酶。
[0035]在另一优选例中，所述聚合酶选自下组：Taq酶、Pfu酶、Tth酶。
[0036]在本专利技术的第二方面，提供了一种检测宿主细胞中目的基因拷贝数的试剂的组合，所述试剂的组合包括针对Psi基因的正向引物和反向引物，针对所述宿主细胞中的单拷贝基因的正向引物和反向引物。
[0037]在一优选例中，所述Psi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0038]在一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞。
[0039]在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
[0040]在另一优选例中，所述宿主细胞选自以下来源的宿主细胞：大鼠、小鼠、犬、家兔、猫、牛、马、猴、人。
[0041]在另一优选例中，所述宿主细胞为人源细胞。
[0042]在另一优选例中，所述的单拷贝基因选自下组：FrIL
‑
2、端粒逆转录酶TERT、β
‑
ACTIN、β
‑
globin、RPPH1、GAPDH。
[0043]在另一优选例中，所述的单拷贝基因为端粒逆转录酶TERT基因。
[0044]在另一优选例中，所述端粒逆转录酶TERT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0045]在另一优选例中，针对Psi基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、4所示；针对TERT基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6、7所示。
[0046]在一优选例中，所述试剂的组合还包括检测所述Psi基因和所述单拷贝基因的探针。
[0047]在一优选例中，所述检测所述Psi基因的探针如SEQ ID NO:5所示；所述检测所述TERT基因的探针如SEQ ID NO:8所示。
[0048]在本专利技术的第三方面，提供了一种PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系包含本专利技术第二方面所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测宿主细胞中目的基因拷贝数的方法，所述目的基因通过慢病毒载体导入，所述方法包括以下步骤：1)检测细胞中Psi基因的拷贝数；2)检测细胞中单拷贝基因的拷贝数；3)按照以下公式计算细胞中目的基因的拷贝数：目的基因拷贝数/细胞＝2
×
Psi拷贝数/单拷贝基因。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Psi基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单拷贝基因选自下组：GAPDH、TERT、β
‑
ACTIN、β
‑
globin、RPPH1。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单拷贝基因是核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的端粒逆转录酶TERT基因。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体是第一代到第三代的HIV

【专利技术属性】
技术研发人员：豆敏华，史斐斐，陈秋燕，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：