盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、专用引物及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、专用引物及其筛选方法和应用，通过对现有的5个候选内参基因在不同盐分浓度的两种枸杞中的荧光定量分析，利用三种软件(GeNorm、NormFinder、BestKeeper)分析，筛选出不同浓度下两种枸杞中均稳定表达的内参基因，该内参基因能避免因为盐分浓度改变而引起的基因的表达不稳定导致的检测结果差异。筛选出Actin基因的表达的稳定性最高，其表达并没有受到不同胁迫处理的影响，是最适合宁夏枸杞、黑果枸杞qRT

【技术实现步骤摘要】
盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、专用引物及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物分子生物
，具体涉及盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、专用引物及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]宁夏枸杞(Lycium barbarum)、黑果枸杞(Lycium ruthenicum)均为茄科枸杞属灌木，耐盐碱、干旱、荒漠，常在绿化造林中用作水土保持的树种，在我国西北等地体现出较高的生态价值，也是中国特有的药食同源类植物，具有较高的研究价值和应用前景。
[0003]实时荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)是一种进行精准核酸定量的重要试验方法，在基因表达研究中被广泛使用。目的基因表达评价的准确度在很大程度上依赖于所选择的内参基因(Reference gene，RG)的表达的稳定性。实时荧光定量PCR因其灵敏度、特异性、准确性、范围广等优点广泛应用于mRNA定量分析、基因表达谱等多方面研究中，其结果的准确性主要依托于根据不同类型的植物样本以及反应进行的条件选择合适的内参基因。在应用qRT
‑
PCR技术进行表达分析时，选择多个内参基因作为校正标准，更有利于研究的准确进行。目前对于枸杞耐盐性的相关研究大多是生理生化变化等内容，盐胁迫下枸杞内参基因的研究几乎没有，常用的内参基因在不同的植物及实验条件下会表现不稳定的性状，从而影响目的基因检测的准确性，且在枸杞应对盐胁迫相关功能基因的精确定量方面存在技术上的不足。
[0004]且现有研究发现，针对不同处理、不同组织部位的植物样品，在进行不同的qRT
‑
PCR反应时，使用一概而论选择的内参基因进行反应分析所得出的研究结果是存在误差的，为此应选择与之对应的内参基因，不应一概而论，这也在一定程度上表明了进行表达分析时筛选合适内参基因的重要性。

技术实现思路

[0005]基于上述技术问题，本专利技术的目的是提供盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因、专用引物及其筛选方法和应用。
[0006]本专利技术保护盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因，所述内参基因为Actin；所述内参基因Actin的序列号如SEQ ID.NO.1所示。
[0007]本专利技术还保护上述盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的专用引物：
[0008]所述内参基因Actin的引物序列是：
[0009]F：5
’‑
CAATCGGGTATTTCAAGGTCAAG
‑3’
；
[0010]R：5
’‑
GAGCAGTGTTTCCCAGCATTG
‑3’
。
[0011]所述盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因在枸杞荧光定量PCR中应用。
[0012]所述的专用引物在枸杞荧光定量PCR中应用。
[0013]本专利技术还保护上述盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法，具体步
骤包括如下：
[0014]步骤1，准备材料：选用长势良好的枸杞组培幼苗，将根部培养基洗净后移至装有清水的培养瓶中，并对枸杞幼苗进行不同盐胁迫处理培养，每个浓度均设置3次重复，每瓶培养瓶内放5～8株幼苗，处理7d后分别采样编号，用液氮速冻后，放置于
‑
80℃超低温冰箱中备用；
[0015]步骤2，总RNA的提取与检测：称取不同浓度盐胁迫后的冷冻枸杞叶片，在液氮中充分研磨，使用植物植物RNA提取试剂盒提取枸杞叶片部分的总RNA，通过Nanodrop OneC超微量分光光度计对提取的RNA进行浓度和纯度(OD值)的测定和检验，筛选出浓度大于100ng
·
μL
‑1且A260/280在2.0～2.2的RNA样品，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性对其浓度纯度进行验证；
[0016]步骤3，合成cDNA第一链：使用PrimeScript TM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒将总RNA反转录合成为cDNA，反应使用10μL体系：5
×
PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL、总RNA模板根据浓度计算，浓度≤500ng、RNase Free dH2O补充到10μL，反应条件为：37℃反转录反应15min，85℃反转录酶的失活反应5s，将反转录后的cDNA放置于
‑
20℃冰箱中，备用；
[0017]步骤4，引物设计：根据枸杞的其他现有研究中筛选出5个茄科植物常用的内参基因GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S为候选内参基因，基于候选内参基因的序列信息，使用Primer5.0软件设计引物并合成，长度20～25bp，CG为45～55％；
[0018]步骤5，PCR验证及qRT
‑
PCR反应：通过普通PCR验证引物的特异性，以所有候选内参基因的cDNA为模板进行普通PCR扩增，反应体系为25μL，其中包括：作为模板的第一链cDNA1μL，Premix TaqEx Taq Version 2.0 plus dye12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，引物使用前稀释到20μM，灭菌水10.5μL；反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min、共35个循环、72℃后延伸5min，再通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行特异性验证；然后根据电泳检测结果，以枸杞cDNA为模板，根据设计的引物进行qRT
‑
PCR反应；
[0019]步骤6，分析内参基因的表达稳定性：分析qRT
‑
PCR反应结果中的周期阈值Ct，分析候选内参基因的稳定性，并对结果绘制统计图，评估其是否适宜用作荧光定量PCR反应的内参基因；使用RefFinder平台基于GeNorm、Normfinder和BestKeeper软件算法对5个候选基因的试验结果进行计算验证，综合各方法得到最为准确、合适的内参基因。
[0020]进一步的，所述步骤1中的枸杞为宁夏枸杞和黑果枸杞。
[0021]进一步的，所述步骤1中不同盐胁迫处理为0(CK)，100，200，300，400mmol
·
L
‑1NaCl溶液。
[0022]进一步的，所述步骤2中植物植物RNA提取试剂盒为TaKaRa MiniBEST。
[0023]进一步的，所述步骤5中，qRT
‑
PCR反应在qRT
‑
PCR仪上进行；反应以2μL枸杞第一链cDNA为模板，加入TB Green
TM Premix Ex Taq
TMⅡ(Tli RNaseH Plus)2
×
12.5μL、PCR正向引物1μL、PCR反向引物1μL、灭菌水8.5μL，共25μL体系，引物使用前稀释到10μM；反应程序为：95℃15min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为Actin；所述内参基因Actin的序列号如SEQ ID.NO.1所示。2.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的专用引物，其特征在于，所述内参基因Actin的引物序列是：F：5
’‑
CAATCGGGTATTTCAAGGTCAAG
‑3’
；R：5
’‑
GAGCAGTGTTTCCCAGCATTG
‑3’
。3.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的应用，其特征在于，所述盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因在枸杞荧光定量PCR中应用。4.根据权利要求3所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的专用引物的应用，其特征在于，所述的专用引物在枸杞荧光定量PCR中应用。5.根据权利要求1所述的盐胁迫下枸杞叶的荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于，具体步骤包括如下：步骤1，准备材料：选用长势良好的枸杞组培幼苗，将根部培养基洗净后移至装有清水的培养瓶中，并对枸杞幼苗进行不同盐胁迫处理培养，每个浓度均设置3次重复，每瓶培养瓶内放5～8株幼苗，处理7d后分别采样编号，用液氮速冻后，放置于
‑
80℃超低温冰箱中备用；步骤2，总RNA的提取与检测：称取不同浓度盐胁迫后的冷冻枸杞叶片，在液氮中充分研磨，使用植物植物RNA提取试剂盒提取枸杞叶片部分的总RNA，通过Nanodrop OneC超微量分光光度计对提取的RNA进行浓度和纯度OD值的测定和检验，筛选出浓度大于100ng
·
μL
‑1且A260/280在2.0～2.2的RNA样品，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性对其浓度纯度进行验证；步骤3，合成cDNA第一链：使用PrimeScript TM RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒将总RNA反转录合成为cDNA，反应使用10μL体系：5
×
PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time 2μL、总RNA模板根据浓度计算，浓度≤500ng、RNase Free dH2O补充到10μL，反应条件为：37℃反转录反应15min，85℃反转录酶的失活反应5s，将反转录后的cDNA放置于
‑
20℃冰箱中，备用；步骤4，引物设计：根据枸杞的其他现有研究中筛选出5个茄科植物常用的内参基因GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S为候选内参基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张得芳，于倩，史文君，
申请(专利权)人：青海省农林科学院，
类型：发明
国别省市：