检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的引物和PCR方法技术

本发明专利技术提供一种检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的引物和PCR方法，所述引物的序列为：FP.F：5

【技术实现步骤摘要】
检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的引物和PCR方法


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)分子检测的特异引物及其在黄芪及土壤中的实时荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]黄芪，具有补气固表，托疮生肌等功效，是中医药学公认的道地大宗药材和保健品原料，以其为原料的中成药多达200余种，上市保健品达160余种，民间也将黄芪作为重要的滋补食材。近年来，黄芪的市场需求激增，出口、药用、食用和其他用途的年需求量在8.85万吨以上。然而，随着种植面积扩大、轮作周期缩短、重茬和迎茬面积增加等因素，素有“植物癌症”之称的根腐病在甘肃、山西、内蒙等主产区普遍发生，且危害逐年加重，如甘肃渭源和定西，发病率分别为40％
‑
60％和35％
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92％；内蒙古为30％
‑
80％；山西一般为10％
‑
30％，重者达60％。根腐病的发生蔓延给黄芪产业的发展造成了严重影响，经济损失巨大。
[0003]尽早准确判别植物病害和明确其致病菌/群，是对病害进行有效防控的最关键一环。然而，黄芪根腐病致病菌的复杂性、症状的多样性、发病的隐蔽性和多年性，给该病害的早期鉴别和针对病原实施精准防控造成了极大困扰。首先，黄芪根腐病由多种病原菌混合侵染引起，镰刀菌属的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是最主要的致病菌，且不同地区优势致病菌存在差异，如甘肃省渭源县黄芪根腐病的优势致病菌为尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌；内蒙古以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为主要致病菌，其次是尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌；山西省为锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌。其次，黄芪根腐病症状多样，具有一定地域差异，且引发不同症状的优势致病菌也不尽相同。以山西为例，纤维状腐烂和皱缩变软在浑源、应县和五寨县均有分布，前者以浑源县和五寨县为多，后者以应县居多；而侧根发黑在浑源县未被发现。引起纤维状腐烂的致病菌，浑源县主要为锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌，五寨县为锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌，应县则为锐顶镰刀菌；引起皱缩软根症状的致病菌，五寨县主要为尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌；浑源县为链格孢菌(Alternaria spp.)、锐顶镰刀菌、腐皮镰刀菌；应县为腐皮镰刀菌和锐顶镰刀菌；引起侧根发黑的致病菌，五寨县和应县均主要为锐顶镰刀菌和腐皮镰刀菌。第三，黄芪根腐病作为土传病害具有隐蔽性。当症状在植株地上部肉眼明显可见时，根部往往已是病害发生的中后期，此时常规施用农药已基本无效，药农不得不加大用量；加之黄芪为多年生植物，为了防止病菌在后续生长年份继续经土壤传播危害，还需要长期用药加以控制。如此，农药用量一再加大，很难控制在合理的范围。
[0004]目前，黄芪根腐病病原菌的鉴定通常采用的是先从发病组织中分离和纯化、再通过形态学和分子生物学技术加以鉴定，这种鉴定方法通常耗时长达半年以上，无法实现病菌的快速鉴定。在田间，症状观察是根腐病诊断的唯一手段，但根腐病早期症状的不明显和隐蔽性，常使得即便药农凭经验通过田间症状观察发现了病害，也往往已到发病后期；加之
根腐症状的多样性，也常导致病害诊断的准确性难以保证。上述种种情形，使根腐病的防治要么“药不对病”、“药不对菌”，要么病害发现太晚，贻误防治时机，最终导致病害防治失败或农药大/超量使用却收效甚微，甚至因农药残留而影响黄芪的品质、污染种植地的土壤环境、造成生态危害。
[0005]基于上述生产实际，亟需建立一种快速、灵敏、准确、可操作性强的根腐病/菌诊断鉴别方法，实现黄芪根腐病的“早发现、早确诊、早防治”、并且能够“对症施药”、“对菌施药”，以期在科学合理施用农药的基础上，既有效控制根腐病的发生蔓延，又可保障人们用药安全，保护生态环境。
[0006]实时荧光定量PCR(Quantitative real
‑
time PCR，qPCR)技术与普通PCR方法相比，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，是病原菌的早期检测和鉴定、病害发生的动态监测、以及植物和土壤中病菌含量测定的有力工具，但针对黄芪根腐病/菌，目前还未见相关检测方法报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种检测黄芪植株及其种植地土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的特异性引物及其实时荧光定量PCR方法，用于黄芪根腐病早期鉴别和诊断、病原菌确定、以及土壤中根腐病菌含量的预警测定。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供一种检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如下：
[0009]FP.F：5
’
—CTGCTTATCTCGGGTCGTGG—3
’
,
[0010]FP.R：5
’
—CTTGTCGATACCACCGCACT—3
’
。
[0011]所述特异性引物对FP.F/FP.R的设计是根据黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌EF
‑
1α序列(GenBank登录号:KX094900)，通过NCBI数据库的Primer
‑
BLAST设计完成。
[0012]所述的特异性引物对可在检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌中应用。
[0013]本专利技术提供一种利用所述的特异性引物对快速检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的方法，包括如下步骤：
[0014](1)取黄芪发病样品或种植地的发病土壤，分别通过Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒和Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒提取黄芪发病样本及土壤的DNA；
[0015](2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求书1所述的特异性引物对FP.F/FP.R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光PCR检测；
[0016](3)利用权利要求书1所述的特异性引物对，以不同浓度梯度的黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，制作黄芪发病样本检测的标准曲线；同样，利用权利要求书1所述的特异性引物对，以模拟不同梯度的黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌带菌量的土壤DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，制作土壤检测的标准曲线；
[0017]所述步骤(2)或步骤(3)中检测黄芪的实时荧光PCR检测的反应条件：95℃ 3min；95℃ 5s；64℃ 20s，35个循环，溶解曲线分析温度设于65～95℃之间；反应体系：反应总体积20μL，其组分为：SYBRGreen I荧光染料10μL，模板DNA 2μL，引物各2μL(浓度为2μM)，ddH2O补足20μL。
[0018]所述步骤(2)或步骤(3)中检测土壤的实时荧光PCR检测的反应条件：95℃ 3min；
95℃ 5s；64℃ 20s，40个循环，反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如下：FP.F：5
’
—CTGCTTATCTCGGGTCGTGG—3
’
,FP.R：5
’
—CTTGTCGATACCACCGCACT—3
’
。2.如权利要求书1所述的特异性引物对在检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌中的应用。3.一种利用权利要求1所述的特异性引物对快速检测黄芪及土壤中根腐病菌腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取黄芪发病样品或种植地的发病土壤，分别通过Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒和Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒提取黄芪发病样本及土壤的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求书1所述的特异性引物对FP.F/FP.R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光PCR检测；(3)利用权利要求书1所述的特异性引物对，以不同浓度梯度的黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，制作黄芪发病样本检测的标准曲线；同样，利用权利要求书1所述的特异性引物对，以模拟不同梯...

【专利技术属性】
技术研发人员：高芬，赵丽梅，赵利，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：