一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、试剂盒及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、试剂盒及其筛选方法和应用，属于菊叶薯蓣育种技术领域，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列如SEQIDNo.2所示；所述引物对能够快速高效的鉴别菊叶薯蓣雌雄株，并且对于不同质量的模板DNA均能够实现稳定准确的鉴定。DNA均能够实现稳定准确的鉴定。DNA均能够实现稳定准确的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、试剂盒及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于菊叶薯蓣育种
，尤其涉及一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、试剂盒及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]菊叶薯蓣(Dioscorea composita Hemsl.)是薯蓣科薯蓣属植物。多年生缠绕性草本。地下茎有的形如掌状，有的棒状迭生；外皮粗糙，黑褐色，分背腹两面；根系完全布于腹。块茎上有芽眼，肉眼难以识别。地上茎圆形肉质，直径0.4
‑
0.7厘米。叶为单叶互生；叶连柄长25
‑
30厘米、宽10
‑
15厘米；主脉突起11
‑
13条；叶面皱摺或平滑，心脏楔形或卵圆形或椭圆形渐尖成尾状；叶柄紫色，或浅或深；叶终年常绿。
[0003]菊叶薯蓣为雌、雄异株，雄株因不结种子而消耗养分少，产量和皂苷含量比同条件下相同的雌株高。但有关薯蓣雌雄性别决定机制的研究相当困乏，且在自然群体中常常出现雄性植株产生两性花，引起自花或异花授粉。因此寻找菊叶薯蓣超雄株，对于开展菊叶薯蓣的全雄育种十分必要；但是目前并没有快速高效的鉴别菊叶薯蓣超雄株的方法。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种能够鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对、试剂盒及其应用。
[0005]本专利技术提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。
[0006]本专利技术提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的试剂盒，包括所述的引物对和检测试剂。
[0007]优选的，所述检测试剂包括PCR扩增试剂。
[0008]本专利技术还提供了所述的引物对、所述的试剂盒在菊叶薯蓣全雄育种中的应用。
[0009]优选的，所述应用为利用所述的引物对对待检测的菊叶薯蓣的基因组DNA进行PCR扩增，若扩增产物有且仅有159bp的片段，则待检测菊叶薯蓣为超雄株，否则不是超雄株。
[0010]本专利技术还提供了鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对的筛选方法，包括以下步骤：
[0011]1)将菊叶薯蓣雌、雄株各3个生物学重复进行转录组学测序获得雌株转录本测序数据和雄株转录本测序数据；
[0012]2)比较步骤1)中所述的雌株转录本数据和雄株转录本数据，筛选在雄株转录本数据中高表达、并且在雌株转录本数据中低表达或不表达的SSR位点；
[0013]3)根据步骤2)筛选获得的SSR位点设计初始扩增引物，
[0014]4)将设计获得的初始扩增引物进行人工修改获得兼并引物；所述人工修改为保留初始扩增引物中上游引物的第5至第19位碱基，将初始扩增引物中的下游引物的第9、11、13、15的碱基替换为N；
[0015]5)分别以菊叶薯蓣雌、雄株的基因组DNA为模板，以步骤4)获得的兼并引物进行热不对称PCR扩增获得扩增产物；
[0016]6)将所述扩增产物进行电泳，挑选菊叶薯蓣雌、雄株扩增产物的差异条带；
[0017]7)将步骤6)中获得的差异条带回收，并测序获得菊叶薯蓣雌、雄株差异序列，根据所述菊叶薯蓣雌、雄株差异序列设计获得二轮扩增引物；
[0018]8)分别以菊叶薯蓣雌、雄株的基因组DNA为模板，以步骤7)获得的二轮扩增引物，进行第二轮PCR扩增，获得二轮扩增产物；
[0019]9)将所述二轮扩增产物进行电泳，挑选菊叶薯蓣雌、雄株扩增产物的差异条带；
[0020]10)将步骤9)中获得的差异条带回收，并测序获得菊叶薯蓣雌、雄株差异序列，根据所述菊叶薯蓣雌、雄株差异序列设计获得三轮扩增引物，即为鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对。
[0021]优选的，步骤1)中的菊叶薯蓣雌、雄株为6年生以上的菊叶薯蓣雌、雄株。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对是通过筛选在雄株转录本数据中高表达、并且在雌株转录本数据中低表达或不表达的SSR位点并设计兼并引物经过多轮扩增筛选后获得的，能够快速高效的鉴别菊叶薯蓣雌雄株，并且对于不同质量的模板DNA均能够实现稳定准确的鉴定。
附图说明
[0023]图1为由初始引物经人工修改获得的25对兼并引物的序列；
[0024]图2为8株雌性、4株雄性共12个模板的热不对称PCR扩增产物的电泳结果；其中F1～F6为雌株模板，M1～M4为雌株模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0025]图3为第二轮PCR扩增产物电泳结果，其中M1～M3为雄株模板，F1～F5为雌株模板，Marker的分子量大小为5000bp；
[0026]图4为第三轮PCR扩增产物电泳结果，其中1～12为雌株模板，13～24为雄株模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0027]图5为以所筛选到的引物对扩增不同质量的DNA模板获得的扩增产物的电泳结果，其中1～16为不同质量的DNA模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0028]图6为以所筛选到的引物对鉴定96株未知性别的菊叶薯蓣材料的结果；
[0029]图7为对比例RAPD的引物扩增结果；其中F1～F6为雌株模板，M1～M4为雌株模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0030]图8为对比例SARP的扩增结果；其中F1～F6为雌株模板，M1～M4为雌株模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0031]图9为对比例ISSR的扩增结果：其中F1～F6为雌株模板，M1～M4为雌株模板；Marker的分子量大小为5000bp；
[0032]图10为SSR分子标记引物扩增结果；
[0033]图11为第一次差异条带挖带回收后没有差异的引物扩增结果；
[0034]图12为为第二次挖带回收后没有差异的引物扩增结果。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；具体如下：
[0036]上游引物(5
’→3’
)：gggtttcttcccttcgctgc(SEQ ID NO.1)
[0037]下游引物(5
’→3’
)：gagatggaaacccaaatgctgac(SEQ ID NO.2)。
[0038]引物性能参数见表1。
[0039]表1引物性能参数
[0040] RatingseqNoLengthTm(℃)GC％δG[kcals/mol]ActivityDegeneracyTaoptsense1003982063.560.0
‑
42,836.91
‑‑
Anti
‑
sense1005562362.547.8
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种鉴别菊叶薯蓣超雄株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和检测试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括PCR扩增试剂。4.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的试剂盒在菊叶薯蓣全雄育种中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为利用权利要求1所述的引物对对待检测的菊叶薯蓣的基因组DNA进行PCR扩增，若扩增产物有且仅有一条159bp的片段，则待检测菊叶薯蓣为超雄株，否则不是超雄株。6.鉴别菊叶薯蓣超雄株的引物对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将菊叶薯蓣雌、雄株材料进行转录组学测序获得雌株转录本测序数据和雄株转录本测序数据；2)比较步骤1)中所述的雌株转录本数据和雄株转录本数据，筛选在雄株转录本数据中高表达、并且在雌株转录本数据中低表达或不表达的SSR位点；3)根据步骤2)筛选获得的SSR位点设计初...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋文芹，田卫华，
申请(专利权)人：天津博奥聚能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：