通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法技术

本发明专利技术涉及通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法。具体而言，在传统的植物育种方法中，化学突变可用于在植物基因组中随机引入核苷酸取代，即不可能控制核苷酸的变化位点。由于基因组的复杂性，就找到预定的核苷酸取代而言，其统计概率极小。然而，本发明专利技术显示了如何研发出一种数字聚合酶链反应(dPCR)优选液滴dPCR(ddPCR)的新的替代用途，以用于发现突变基因中特定核苷酸取代。整个平台包括具有突变生物体文库的筛选方法，基于数字PCR的系统和用于繁殖和分析经鉴定的突变生物体的装置。的装置。的装置。

【技术实现步骤摘要】
通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法
[0001]本申请是申请号为201780041101.5，申请日为2017年6月23日，专利技术名称为“通过应用混合分裂方法筛选生物群体内突变体的方法”的中国专利申请的分案申请。
专利

[0002]本专利技术提供了高度加速的方法和工艺，其可以在实践中扩展和处理生物体的制备、选择和/或繁殖，所述生物体在一个或多个感兴趣的核苷酸(NOI)位点具有特定的、预定的突变。例如，本专利技术的方法可用于提高制备植物的速度和能力，所述植物在一个或多个NOI具有特定的、预定的突变。

技术介绍

[0003]生成遗传修饰(GM)生物体(GMO)的遗传方法广泛可用。然而，出于许多目的，特别是在食品和饮料工业中，GMO的应用通常不太合乎需要。因此，仍然存在着长期需求以提供改进的和更精确的方法用于传统的作物育种，包括谷物如大麦，从而简单地获得用于开发和制造新产品的更好的定制原料。在其他生物体中也存在类似缺点，包括微生物和动物。遗憾的是，传统育种方法中缺乏一种解决发现基因组中预定核苷酸突变的方法，从而限制了原料开发的进程。
[0004]存在允许基因组编辑和在生物体基因组中的靶向位点引入双链DNA断裂的方法，例如通过CRISPR
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Cas9技术(Jiang等，2016)。CRISPR
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Cas9技术存在两个明确的主要相关问题：
[0005]‑
首先，CRISPR
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Cas9技术可被视为基于GM。因此，缺乏基本立法信息，即当局旨在如何规范基因组编辑的新遗传工具，包括在基因组中的靶向位点引入双链DNA断裂；
[0006]‑
其次，存在与CRISPR
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Cas9技术的脱靶切割有关的主要问题。
[0007]在自然环境中的种系突变，例如导致生物体表型后果的突变，既代表了遗传性状变异的主要原因，也是分子水平上有利或破坏性影响的进化改变的最终来源。突变由多种因素引起，包括：
[0008]‑
复制错误；
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DNA损伤，要么未正确修复要么未修复；
[0010]‑
由外源因素引起的DNA损伤
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例如化学品、紫外线和电离辐射；
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内生因素，例如活性氧、醛类或有丝分裂错误；
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参与DNA修复或基因组编辑的酶；
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插入DNA片段的病毒和内源性反转录转座子。
[0014]此外，目前的理解是暴露于突变剂可能诱导大量的体细胞基因突变，其中大部分没有明显的选择性优势，但有些可能改变关键的细胞功能。此外，一些基因组相关特性可能是非突变的，例如表观遗传变化和细胞微环境的改变。
[0015]传统的作物育种涉及随机诱变，然后筛选所需的性状。遗憾的是，缺乏有效的筛选方法来鉴定预定的基因变化，即突变生物体的基因或调节元件中的特定核苷酸取代，例如
没有采用基于GM的方法的谷物。实际上，GM植物在性状开发本身的定向方法和更广泛的科学应用方面经历了＞10年的竞争优势。然而，如上所述，基于GM的方法并不是优选的。
[0016]最近开发的基因组测序技术的结果彻底改变了对性状遗传结构的理解(以及响应于诱变的相应变化)。例如人们普遍期望的是，全基因组测序和新的计算方法在大的高通量gDNA测序的帮助下将有助于回答几个基本的生物学问题并加速突变体表征，例如，使用单子叶谷类植物大麦。
[0017]在真核生物中，一些突变过程似乎在基因组分布上显示出相当大的变异(Pleasance等，2010；和Lehner，2012)。点突变的数量沿着基因组变化，并且在低基因表达水平、抑制的染色质和晚期复制时间的序列区域中通常更高。这种变化中的一些可以通过减少错配修复机制对闭合染色质区域的访问来实现。
[0018]鉴于上面提供的背景信息，谷物研究领域的技术人员将会知道，所述分析进展使大麦和谷物研究成为新领域的门槛，特别是在基于分子生物学的深入理解和具有新特征植物的工业应用之间的R&D阶段。也就是说，尽管用于突变体鉴定的基因组测序技术取得了进展，但这些方法仍然耗时且在逻辑上具有挑战性，并且对于鉴定特定的预定突变几乎没有用处。
[0019]另外两个属性仍然令人感兴趣，不仅涉及鉴定具有预定突变的植物，而且涉及利用改进：
[0020]‑
划定谷物种系和体细胞突变率的范围。
[0021]‑
目前的方法集中在gDNA片段突变体搜寻的范围缩小，其基于背景非依赖性的gDNA序列分析[例如，Tilling方法，其仅限于筛选最多5,000到10,000个突变体，以及突变体和野生型衍生gDNA片段之间的熔点差异(Botticella等，2011)]。
[0022]到目前为止，使用非GM方法找到预定的和复杂的突变被认为是不现实的。同样沿着这条线，没有关于何种样品大小可以可靠地鉴定出感兴趣的特定核苷酸取代的提示。现在，通过本公开中提供的指导可以实现这一点。

技术实现思路

[0023]本专利技术公开了发现在一个或多个靶序列中具有预定的感兴趣的核苷酸突变的单个、传统开发的生物体的方法。所述突变可以是赋予特定、有用性状的基因突变。
[0024]特别地，基于对突变结构的令人惊讶的新颖见解，本专利技术提供了用于突变体发现应用的惊人的但相对简单的、新的全基因组方法。本专利技术提供了鉴定在一个或多个NOI具有预定突变的生物体的方法。预定突变可以是任何期望的突变。因此，本专利技术提供了非GM方法，其能够鉴定具有特定突变的生物体。归因于PCR技术特别是数字PCR的创造性利用，这成为可能。因此，本专利技术公开了一种定位用于筛选的突变DNA背景的新方法，其与逻辑创新的系统相结合，该系统能够分析突变生物体的巨大集合。
[0025]还公开了耗时间少、处理最小化的新操作，其完成了寻找罕见突变的挑战性任务，例如预计位于谷粒核的上述闭合染色质区域的那些突变，包括大麦的那些突变。利用对全基因组序列的访问来设计用于所述方法的引物和/或探针。因此，全大麦基因组序列(Ensembl Plants中的大麦基因组集合，版本号082214v1)可用于设计特定基因的引物和探针，非常适合于提高发现具有预定突变的植物的速率。
[0026]在一个实施方案中，本专利技术提供了通过传统或常规育种方法搜索预定突变的方法，所述预定突变例如是导致基因中的核苷酸取代的突变，与谷物性状相关。利用所公开的方法，提出了有助于阐明与内源诱变和诱导诱变相关的潜在分子机制的方法。
[0027]本专利技术在所附权利要求中限定。
[0028]本专利技术提供了鉴定预定物种的生物体的方法，所述生物体在靶序列的NOI携带一种或多种预定突变，所述方法包括以下步骤：
[0029]a)提供代表多个基因型的所述物种生物体或其繁殖部分的池；
[0030]b)将所述池划分为一个或多个生物体或其繁殖部分的子池；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定预定物种生物体或其繁殖部分的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的预定物种生物体，所述方法包括以下步骤：a)提供代表多个基因型的所述物种的生物体或其繁殖部分的池；b)将所述池划分为一个或多个生物体或其繁殖部分的子池，其中每个子池均包括多于一个的每种基因型的单个生物或其繁殖部分，其中来自所述池的一个生物体或其繁殖部分的所有后代都包括在一个子池中；c)以如下方式将每个子池随机分成多个部分：使得每个部分理论上包括代表所述子池的每种基因型的生物体或其繁殖部分；d)从每个子池的所述多个部分之一制备基因组DNA(gDNA)样品，同时在保持繁殖潜力的条件下保存生物体或其繁殖部分的剩余部分；e)进行多个PCR扩增，每个PCR扩增均包含来自一个子池的gDNA样品，一组或多组引物和PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列的侧翼；f)检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI中的突变，从而鉴定包含所述突变的子池。2.根据权利要求1所述的方法，其中物种是单细胞生物体，例如酵母。3.根据权利要求1所述的方法，其中物种是植物，并且所述方法的步骤a)和b)包括以下步骤：I.提供植物的多个繁殖部分；II.随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；III.使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；IV.任选地，重复步骤III.X次，以获得包含M(1+X)代繁殖部分的植物；V.从所述成熟植物中获得M1或M(1+X)代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；VI.将步骤V.中获得的所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中。4.一种鉴定预定植物物种的植物或其繁殖部分的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的植物，所述方法包括以下步骤：
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提供植物的多个繁殖部分；
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随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；
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使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；
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任选地，重复前述步骤X次，以获得包含M(1+X)代繁殖部分的植物；
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从所述成熟植物中获得M1或M(1+X)代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；
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将所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中
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制备基因组DNA(gDNA)样品，每个样品均包含来自一个子池内每个基因型的gDNA，同时保持所述子池内每个基因型的植物的增殖潜力；
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进行多个PCR扩增，每个PCR扩增均包含来自一个子池的gDNA样品，一组或多组引物和
PCR试剂，从而扩增靶序列，所述一组或多组引物的每一组均位于靶序列的侧翼；
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检测包含一个或多个靶序列的PCR扩增产物，所述靶序列包含NOI中的突变，从而鉴定包含所述突变的子池。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中物种是植物，并且所述方法的步骤a)和b)包括以下步骤：I.提供植物的多个繁殖部分；II.随机诱变所述繁殖部分，从而获得M0代的繁殖部分；III.使所述M0代的繁殖部分生长为成熟植物，并从所述成熟植物获得繁殖部分，其中所述繁殖部分是M1代繁殖部分；V.从所述成熟植物中获得M1代的繁殖部分，从而获得繁殖部分池；VI.将步骤V.中获得的所述繁殖部分池分成子池，其中来自给定成熟植物的所有繁殖部分被放入相同的子池中。6.根据权利要求1和3
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5任一项所述的方法，其中物种是植物，例如大麦。7.根据权利要求1和3
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5任一项所述的方法，其中繁殖部分是种子。8.根据权利要求1和3
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5任一项所述的方法，其中将M0代的繁殖部分池分成子池的步骤包括以下步骤：
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在不同田块中培育M0代繁殖部分，使其生长为成熟植物，其中所述成熟植物的繁殖部分构成了繁殖部分池；
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将所述区域划分为小田块；
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在一个小田块中收获所有植物的所有繁殖部分，从而获得繁殖部分子池。9.根据权利要求8所述的方法，其中在分开的容器中培养繁殖部分，例如在温室中。10.一种鉴定预定单细胞生物物种的生物体的子池的方法，其中所述子池包括在靶序列中携带感兴趣核苷酸(NOI)的一种或多种预定突变的预定单细胞物种的生物体，所述方法包括以下步骤：a)提供代表多个基因型的所述单细胞生物物种的生物体的池；b)将所述池划分为一个或多个生物体的子池；c)使每个子池经历繁殖步骤；d)以如下方式将每个子池随机分成多个部分：使得每个部分理论上包括代表所述子池的每种基因型的生物体；e)从每个子池的所述多个部分之一制备基...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：嘉士伯有限公司，
类型：发明
国别省市：