基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法技术

本发明专利技术提供了一种基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，即采用激光捕获显微切割的磁珠法痕量分析及质谱分析方法，具体包括通过激光捕获显微切割技术切割福尔马林固定石蜡包埋等组织切片的痕量目标组织，并收集至管盖中；加入裂解液完全覆盖痕量目标组织，在恒温水浴中原位孵育裂解；裂解得到的蛋白质溶液中加入还原剂和烷基化试剂进行反应；再加入磁珠和乙醇，然后加入缓冲液、蛋白水解酶进行酶解；将肽段溶液进行色谱分离和质谱检测；本发明专利技术的空间分辨蛋白质组学方法能够显著降低单个样本所需的起始组织量，显著提升蛋白质提取效率和质谱鉴定能力，从而可以与现有主流空间分辨转录组技术的分辨率对接。主流空间分辨转录组技术的分辨率对接。主流空间分辨转录组技术的分辨率对接。

【技术实现步骤摘要】
基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法


[0001]本专利技术属于蛋白分析
，具体涉及一种基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法。

技术介绍

[0002]蛋白质是细胞功能的实际执行者，近年来基于质谱的蛋白质组学技术的进步，促进了对临床组织样本的蛋白质组学研究，从而推动了对疾病的认识和治疗。然而传统的蛋白质组学方法往往将临床组织作为整体进行蛋白质提取、酶解和分析，导致细胞异质性和空间定位信息的丢失。激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)是一种能从组织中分离出特定细胞群体或组织学区域、同时保留空间定位信息的技术，其发展使特异性地对组织样品中某一个或一类细胞进行空间分辨蛋白质组学研究成为可能。2021年初，Nature methods将空间分辨转录组技术(Spatially resolved transcriptomics,SRT)评为2020年度方法。然而，具有高灵敏度的空间分辨蛋白质组技术(Spatially resolved proteomics,SRP)的开发与应用是蛋白质组学领域的瓶颈之一。与已经发展到较高分辨率的测序技术相比，匹配空间转录组的空间蛋白质组技术平台还处在发展的伊始。
[0003]福尔马林固定石蜡包埋(Formalin
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Fixed and Parrffin
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Embedded,FFPE)是临床与科研领域保存组织样品最常用的方法，在室温下储存数十年的FFPE样品中的蛋白质信息依然可以保持稳定。将巨大的FFPE样品库与LCM技术相结合，能为空间分辨蛋白质组学研究提供宝贵的资源。然而，为了提高空间分辨率，一个LCM样品可能只包含几十到几百个细胞，对应的亚微克级别的蛋白质很容易在酶解和脱盐等前处理步骤中损失。同时，极低的样品量对色谱分离方法和质谱检测的灵敏度也提出了新的要求。
[0004]为了减少亚微克级蛋白质样品在前处理过程中的损失，有课题组开发了一种基于亲水性顺磁珠的one
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pot蛋白质前处理方法(Single
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pot,Solid
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phase
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enhanced Sample
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preparation,SP3)，能够相对快速、高效地除去组织裂解、蛋白质提取和酶解过程中引入的去垢剂和无机盐，并减少转移过程对痕量样品造成的巨大损失。然而该方法仅适用于处理来自细胞或新鲜组织的微量蛋白质样品，在处理FFPE组织时需要5mm
×
5mm
×
5μm的起始样品量。过大的组织取样面积会急剧降低空间分辨率，使组织中来自不同的细胞信息被同质化，难以针对性地分析组织中珍贵的细胞类型。此外，FFPE组织制备中的甲醛固定及石蜡包埋处理会导致组织细胞中的蛋白质发生广泛的分子交联，限制了蛋白质的提取效率，损害了免疫反应活性，还会导致质谱对蛋白质的鉴定能力大幅下降。因此，要想通过LCM技术和质谱技术从痕量FFPE样本中选取高分辨率的空间分辨蛋白质组学信息，就需要针对性地开发适用于痕量FFPE样本的空间分辨蛋白质组学前处理方法和质谱分析方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种适用于LCM产生的痕量组织样
品的蛋白质组学前处理方法：即采用激光捕获显微切割的磁珠法痕量分析(LCM
‑
Magnetic Trace Analysis,LCM
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MTA)及质谱分析方法，能够显著降低单个样本所需的起始组织面积，提升蛋白质提取效率和质谱鉴定能力。
[0006]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0007]一种基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其包括如下步骤：
[0008](1)、将组织切片置于激光捕获显微切割(LCM)仪的载物台上，选取目标组织后，进行切割并收集至显微切割专用管的管盖上；
[0009](2)、向步骤(1)的管盖上加入裂解液，并完全覆盖目标组织，在50
‑
70℃水浴下原位孵育裂解1.5
‑
2.5h，之后将含蛋白质的裂解液离心收集至管底；
[0010](3)、向步骤(2)裂解得到的蛋白质溶液中加入终浓度为5
‑
20mmol/L的还原剂和终浓度为10
‑
100mmol/L的烷基化试剂进行一步反应或顺次反应，蛋白质的还原烷基化的反应体系中，烷基化试剂终浓度不低于还原剂终浓度的2倍，之后冷却至室温；
[0011](4)、向步骤(3)中加入0.5
‑
1.5μl、30
‑
70μg/μl的磁珠，再加入乙醇，之后在室温下震荡混匀，于磁力架上静置后去除上清液，用不同浓度的乙醇冲洗磁珠；
[0012](5)、在步骤(4)冲洗后的磁珠中加入缓冲液，在水浴中超声，加入终浓度为1
‑
100ng/μl的蛋白水解酶，在恒温振荡仪上300
‑
1500rpm边震荡边酶解蛋白质溶液；
[0013](6)、步骤(5)酶解4
‑
24h的样品于磁力架上静置后，收集上清液并加入甲酸溶液至终浓度0.1
‑
1wt％进行酸化终止酶解反应；
[0014](7)、将步骤(6)的肽段溶液进行色谱分离和质谱检测。
[0015]作为本专利技术优选地，步骤(1)中，组织切片的厚度为3
‑
20μm。
[0016]作为本专利技术优选地，步骤(1)中，组织切片选自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织切片、组织芯片或新鲜组织的冰冻切片中的一种以上。
[0017]作为本专利技术优选地，步骤(2)中，水浴的温度为60℃，原位孵育裂解的时间为2h。
[0018]作为本专利技术优选地，步骤(2)中，裂解液包括十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X
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100)、吐温20(Tween 20)、乙基苯基聚乙二醇(NP
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40)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、甘油(glycerol)、蛋白酶抑制剂(cOmplete protease inhibitor)和二硫苏糖醇(DTT)。
[0019]作为本专利技术优选地，步骤(2)中，裂解液需覆盖痕量组织，推荐加入的裂解液需铺满黏附或承装痕量组织的管盖等容器底部，以保障完全裂解。
[0020]作为本专利技术优选地，步骤(3)中，还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)或三(2
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羧乙基)膦(TCEP)中的一种以上。
[0021]作为本专利技术优选地，步骤(3)中，烷基化试剂选自碘乙酰胺(IAA或IAM，iodoacetamide)、氯乙酰氨(CAA或ClAM，chlo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)、将组织切片置于激光捕获显微切割仪的载物台上，选取目标组织后，进行切割并收集至显微切割专用管的管盖上；(2)、向步骤(1)的管盖上加入裂解液，并完全覆盖目标组织，在50
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70℃水浴下原位孵育裂解1.5
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2.5h，之后将含蛋白质的裂解液离心收集至管底；(3)、向步骤(2)裂解得到的蛋白质溶液中加入终浓度为5
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20mmol/L的还原剂和终浓度为10
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100mmol/L的烷基化试剂进行一步反应或顺次反应，蛋白质的还原烷基化的反应体系中，烷基化试剂终浓度不低于还原剂终浓度的2倍，之后冷却至室温；(4)、向步骤(3)中加入0.5
‑
1.5μl、30
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70μg/μl的磁珠，再加入乙醇，之后在室温下震荡混匀，于磁力架上静置后去除上清液，用不同浓度的乙醇冲洗磁珠；(5)、在步骤(4)冲洗后的磁珠中加入缓冲液，在水浴中超声，加入终浓度为1
‑
100ng/μl蛋白水解酶，在恒温振荡仪上300
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1500rpm边震荡边酶解蛋白质溶液；(6)、步骤(5)酶解4
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24h的样品于磁力架上静置后，收集上清液并加入甲酸溶液至终浓度0.1
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1wt％进行酸化终止酶解反应；(7)、将步骤(6)的肽段溶液进行色谱分离和质谱检测。2.根据权利要求1所述的基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其特征在于：步骤(1)中，所述组织切片的厚度为3
‑
20μm。3.根据权利要求1所述的基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其特征在于：步骤(1)中，所述组织切片选自福尔马林固定石蜡包埋组织切片、组织芯片或新鲜组织的冰冻切片中的一种以上。4.根据权利要求1所述的基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水浴的温度为60℃，所述原位孵育裂解的时间为2h。5.根据权利要求1所述的基于激光捕获显微切割技术的空间分辨蛋白质组学方法，其特征在于：步骤(2)中，所述裂解液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，李辰，顾蕾，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：